鈣離子在很多生理活動中都發揮著重要作用，除了在肌肉細胞收縮中扮演著重要角色，鈣離子也是神經元活動的重要「風向標」之一：當神經元膜電位發生去極化，產生的動作電位傳導到神經元軸突末梢時，細胞膜上的電壓門控鈣離子通道打開，大量鈣離子內流，包含神經遞質的囊泡由突觸前膜釋放至後膜，下遊神經元就得以接受到上遊的信號。因此，鈣離子成像可以追蹤神經元動作電位，從而幫助我們了解神經元集群的活動，可以用於感知覺，學習記憶，社會性行為等各種各樣的研究中。
圖1 Prime 95B 拍攝的小鼠大腦嗅球區域接受嗅覺刺激時的鈣離子信號 (Thy1-GCaMP6f-GP5.11)(From Dr. David Gire, 華盛頓大學心理學系)
鈣離子指示劑
想要對鈣離子的動態變化進行有效的檢測，鈣離子指示劑的選擇顯得尤為重要。鈣離子螢光指示劑在未結合鈣離子前幾乎無螢光，與鈣離子結合後，螢光強度顯著增強。利用這一原理，可以通過指示劑的信號強弱來觀察細胞內鈣離子濃度水平的變化。
根據激發光波長範圍，鈣離子指示劑可以分為可見光激發和紫外光激發，而根據其工作原理又可以分為比率和非比率型。下面我們就來詳細了解一下幾種常見的鈣離子指示劑：
1. 紫外光激發Ca2+螢光探針
Fura-2 和 Indo-1 都是紫外光激發的雙波長 Ca2+ 螢光指示劑，也是目前最常用的比率型鈣離子螢光探針。與其他第一代的螢光指示劑相比，它們的螢光信號更強，對Ca2+ 的選擇性也更強。
比率指示劑會在與 Ca2+ 結合後會改變吸收/發射特性。以雙波長激發指示劑 Fura-2 為例。如圖 2 所示，低 Ca2+ 濃度下，Fura-2 在 ~380nm 處激發，高 Ca2+ 濃度下，在 ~340nm 處激發。光譜由兩個峰組成：左側較短波長的吸收峰隨 Ca2+ 濃度的增加而增大，右側較長波長的吸收峰隨 Ca2+ 濃度的增加而減小。通過 340/380nm 交替激發，獲取在 510nm 處對應的發射光螢光強度的比率，就可以對 Ca2+ 濃度進行定量的測量。因為 Fura-2 結果準確，且不易被漂白，所以得到了廣泛使用。
圖2 Fura-2 激發光譜（Ca2+ 濃度0-39.8 μM）
還有另一種雙波長發射指示劑 Indo-1，在 340nm 處用單一波長激發，在 400nm 和 480nm 處分別檢測結合和未結合 Ca2+ 的螢光信號，通過二者的比率確定 Ca2+ 濃度。它的優點與 Fura-2 相似，但更容易被漂白，應用時需要儘量減少激發光強和照射時間。
使用比率型指示劑標定 Ca2+ 濃度可以消除實驗中的一些幹擾和不確定性，如染料分布不均勻，染料吸收差異，細胞運動，自發螢光，細胞厚度差異等。不過，大多數比率指示劑必須在 400nm 以下被激發。而用紫外/近紫外光照射細胞可能導致細胞死亡（凋亡），特別是在長時間實驗中。
2. 可見光激發Ca2+螢光探針
與紫外光激發探針相比，可見光激發 Ca2+ 探針具有更強的染料吸收性能，對 Ca2+ 變化水平檢測敏感度也更高，能夠降低對活細胞的光毒性和樣品自發螢光以及光散射的幹擾，且無光譜偏移。最常使用的可見光激發 Ca2+ 螢光探針有 Fluo-3，Fluo-4，Rhod-2 等，同時他們也都是非比率型指示劑。
Fluo-3 是最常用的可見光激發 Ca2+ 螢光指示劑之一，是典型的的單波長指示劑，最大激發波長為 506nm，最大發射波長為 526nm。它與 Ca2+ 結合之前幾乎無螢光，結合後螢光會增加 60 至 100 倍，從而避免了細胞自身的螢光幹擾。實際檢測時推薦使用的激發波長為 488nm 左右，發射波長為 525～530nm（圖 3）。Fluo-3 可以用在雷射共聚焦顯微成像或流式細胞儀中。它還有一個升級版本 Fluo-4，在相同 Ca2+ 濃度下信號更強。
圖3 Fluo-3 發射光譜（Ca2+ 濃度0-39.8 μM）
Rhod-2 是另一種可見光激發的高親和力 Ca2+ 指示劑，與 Fluo-3/4 相比，Rhod-2 激發和發射波長都更長。在 540nm 處被激發，發射波長在 580nm 以上，更適用於具有較高自發螢光現象的細胞和組織。
3. 轉基因 Ca2+ 指示劑
轉基因技術和光遺傳技術的飛速發展，催生了基因編碼的 Ca2+ 指示劑（GECIs）。它們不依賴於螢光染料，可以靶向特定的組織，如神經細胞、心肌細胞、T細胞等，並且可以避免螢光指示劑帶來的的許多問題，是監測活體轉基因動物體內鈣離子的一個極好的工具。
第一個基因編碼的鈣離子指示劑 Cameleon 早在1997年就發表了。它是利用與鈣離子結合後發生結構變化，作為供體的 CFP 和作為受體的 YFP 之間產生 FRET 的原理（圖 4）。
圖4 Cameleon發光原理 (Grienberger & Konnerth. 2012)
2000年，GCaMP 誕生了。它是增強型綠色螢光蛋白（EGFP）和鈣調蛋白（結合鈣離子）、鈣調蛋白結合肽 M13 組成的，結合鈣離子後，鈣調素-M13相互作用引起GFP空間結構變化，發出綠色螢光（圖 5）。GCaMP 的問世有著革命性的意義，它改變了我們觀察神經元群體活動的方式，讓科學家們可以在成千上萬的細胞中，看到哪些神經元在放電，它們放電的模式和規律是怎樣的，從而進一步探索各種內在的神經機制。
圖5 GCaMP發光原理 (Grienberger & Konnerth. 2012)
GCaMP 顯著增加了發射光強度，可以同時對鈣離子和其他感興趣的結構進行成像。此後，GCaMP 經歷了各種迭代，變得更亮更快。此外，還發表了紅色螢光版RCaMP，避免紫外/近紫外激髮帶來的的副作用。
鈣離子成像系統
傳統的寬場螢光顯微鏡由於光散射的影響，只能夠對大腦淺層的神經元或在離體組織上進行成像，共聚焦顯微鏡由於光損傷較大，一般也只用於離體鈣成像。
隨著螢光顯微鏡技術的迅速發展，在體鈣成像技術得到了蓬勃發展。雙光子螢光顯微鏡能夠在進行活體成像的時候實現高解析度和高信噪比。例如，用雙光子顯微鏡對海馬樹突棘的鈣離子信號進行成像，研究神經元突觸後長時程抑制 (Wang et al., 2000)；觀察活體小鼠運動皮層神經元在嗅覺選擇任務中刺激相關電位 (Komiyama et al., 2010)等等。不過，這些實驗還是需要對動物進行麻醉和固定，而神經科學領域很多研究更希望能夠對自由活動的動物進行研究。
近年來出現了通過植入性的 microscope 或 microlens 進行活體 freely moving 動物鈣成像的技術。如圖 6 中所示的光纖成像法：使用一端帶有 GRIN lens 的光纖連接顯微鏡和動物大腦，從特定腦區發出的螢光信號被光纖收集，然後通過相機成像。動物頭部只需植入 GRIN lens，方便活動，而且可以同時植入多個 lens 來觀察不同的腦區之間的聯繫和相互作用。不過這種成像方法的視野較小，解析度也比較差。
圖6 光纖微透鏡成像（Epifluorescence fiberscope）(Yang & Yuste, 2017)
圖 7 所示的直接植入動物大腦的微型螢光顯微鏡，將 GRIN lens 直接植入皮層下的海馬，下丘腦，丘腦等區域，可以監測深部腦區的神經元活動。這種微型顯微鏡的重量只有幾克，不會影響動物自由活動，可以提供 800μm × 600μm 視野和 1.50μm 橫向解析度。和光纖成像一樣，這種植入型的鈣成像設備對手術的要求很高，損傷也比較大。
圖7 微型螢光顯微鏡（Epifluorescence miniature microscope）(Yang & Yuste, 2017)
相機選擇
多種鈣離子指示劑和鈣成像手段的存在使研究人員能夠根據具體的實驗需要進行選擇。同樣，選擇合適的檢測設備也是至關重要的。對於使用 CCD/sCMOS 相機的成像系統來說，有兩個要求是最基本的：採集速度：根據不同的應用所需的相機幀速也不同，對於神經細胞來說，一般要求相機速度至少在 10fps 以上，有些高速應用場景可能需要幾百甚至上千 Hz 的幀速。
靈敏度：為了儘可能降低光漂白和其他副作用（特別是藍光激發時），需要降低激發光強度。因此相機要在較寬的發射光波長範圍上具有高靈敏度，才能檢測到弱光條件下的信號，並適應不同的染料的光譜發射特性。
此外，在一些特定研究中，相機的視野也是一個重要因素。當研究在神經元中表達 GECIs 的器官型腦片的行為時，例如想要同時觀察軸突和樹突的鈣離子信號，大視野是很重要的。而在膜片鉗系統上。只對單個細胞成像的情況下，通常使用低放大倍率和低數值孔徑的物鏡，這時候相機視野較小也問題不大。
對於鈣離子成像來說，大多數情況下速度更為重要，所以一般會犧牲解析度。過去，EMCCD 由於其高靈敏度、高QE和高速而被廣泛應用。如今，背照式 sCMOS 相機（圖8）由於具有相當的靈敏度和更高的速度而更受歡迎。
圖8 Teledyne photometrics Prime 系列背照式sCMOS相機
點擊下方連結，閱讀 Teledyne Photometrics sCMOS 相機用於鈣離子成像的應用案例：
Prime BSI 應用｜ 鈣離子成像
Prime 95B應用｜ 鈣離子成像
References
Akerboom, J. et al. (2013) Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Front Mol Neurosci. Mar. 2013
Grienberger, C. & Konnerth, A. (2012). Imaging Calcium in Neurons. Neuron Mar.2012
Heindorf, M. & Hasan, M. T. (2015) Fluorescent Calcium Indicator Protein Expression in the Brain Using Tetracycline- Responsive Transgenic Mice. Cold Spring Harb Protoc. Jul.2015
Miyawaki, A. et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. Aug. 1997
Weijian Yang & Rafael Yuste. In vivo imaging of neural activity. Nature methods. Apr. 2017.