專家詳解螢光定量PCR儀開展病毒檢測工作的原理和計量知識

守護好新冠病毒檢測的「透明屋」

專家詳解螢光定量PCR儀開展病毒檢測工作的原理和計量知識

□ 本報記者 張文禮

近期，新冠病毒感染的肺炎疫情牽動著全國人民的心。當前，打贏疫情防控阻擊戰進入關鍵時期，快速完成疑似病例確診，成為最為關鍵的工作之一。

要快速精確地完成確診工作，檢測設備和儀器成為重要的前提。那麼，新冠病毒是如何確診的？檢測設備是如何做到精確測量的？設備不準確會造成什麼後果？近日，圍繞這些問題，記者採訪了南京市計量監督檢測院（以下簡稱南京市計量院）總工程師胡寧、醫療器械部副部長陳鴻飛。

確診病毒這兩種設備必不可少

據胡寧介紹，要檢測出新冠病毒，首先需要病毒核酸檢測試劑盒。由於核酸檢測試劑盒需要針對特定的病毒進行單獨研發生產，這就造成了在疫情前期確診病例較少、而後期確診病例直線上升。同時，要做到最終檢測確診病毒，就需要使用到實時螢光定量PCR儀，該設備能否檢測確診病毒的關鍵，其工作狀態如何，將直接影響病毒檢測的效率和精準度。

記者了解到，螢光定量PCR儀作為確診新冠病毒的定量分析儀器，對新冠病毒的檢測確認至關重要，且病毒檢測對設備精度要求比較高。同時，由於螢光定量PCR儀設備價值較高（最便宜的螢光定量PCR儀約30萬元，最高級的將近100萬元），一般只有省市一級疾控中心、大中城市的三級醫院等機構才擁有，且檢測工作必須是國家相關部門指定的較高級別的、具有資質的生物安全實驗室得到的數據才能被認可，這也從一個方面導致了前期病例確診較慢。

計量人員對螢光定量PCR儀進行檢定校準

那麼，螢光定量PCR儀在病毒的快速確診方面能起多大作用呢？據陳鴻飛介紹，根據國家衛健委發布的《新冠肺炎診療方案（試行第四版）含最新中醫診療方案》，實時螢光RT-PCR檢測被列為確診病例的兩種方法之一，而且憑藉時間短、成本低等特點，已成為應用最廣的確診新冠病毒的方法。

儀器不準會直接導致病毒誤測

針對螢光定量PCR儀進行病毒檢測的流程問題，陳鴻飛介紹說，首先，由實驗室在病人呼吸道樣本或血液樣本中分離出的病毒進行處理，提取出病毒核酸這一特定的「身份證」（病毒基因序列）。其次，將病毒核酸與試劑盒內各組分混合形成完整的RT-PCR反應體系，放入螢光定量PCR儀後，進行螢光定量PCR反應，根據實時監測反應的螢光曲線來判定是否為新冠病毒。

按照陳鴻飛的介紹，在具體操作中，檢測人員會將提取病人的核酸樣本和試劑盒配比好之後，放到螢光定量PCR儀中進行PCR反應，通過溫度的升降，病人樣本中的新冠病毒核酸會被特異性的引物探針識別，從而進行快速複製，導致其螢光信號倍增，儀器會檢測到相應呈倍數擴增的曲線，並以此來最終確診病人樣本中是否含有新冠病毒。也就是說，螢光定量PCR儀更像是一間「房屋」——一間為病毒和試劑盒中試劑提供反應體系、可以進行詳細觀察的「透明屋」。

「螢光定量PCR儀檢測中的誤差隨時都會導致誤診情況的出現，必須要確保其檢測的可靠性。」陳鴻飛說：「比如在溫度控制的時候，按照標準要求溫度準確度誤差要求在±0.5℃之內，溫度均勻性誤差不大於1.0℃。如果溫度誤差過大，比如超過1.0℃甚至更大的話，會造成本來應該進行的PCR擴增反應無法正常進行或是擴增效率降低，此時應該顯示陽性的樣本螢光曲線會呈現出假陰性，直接導致對病毒的誤測，造成嚴重的後果。螢光檢測模塊如果有問題，會導致儀器無法檢測到正確的螢光信號，也同樣會導致儀器得到病人樣本錯誤結果。」

計量工作提供重要技術支撐

螢光定量PCR儀在病毒檢測確診中扮演了如此重要的作用，其自身的精準可靠便顯得愈加重要。而要實現這個目標，計量工作在其中起到了重要的技術支撐作用。

此次新冠肺炎疫情發生後，南京市疾控中心緊急報檢，請求南京市計量院對該中心的4臺螢光定量PCR儀進行檢定校準。

胡寧告訴記者，由於使用該儀器的都是處在防疫一線的部門，所以在檢定工作中一定要確保人員的絕對安全和儀器的準確可靠。接到報檢請求後，南京市計量院圍繞南京市疾控中心快速檢定、精準檢定的實際需要，優化流程，快速響應，派出精兵強將，在最短的時限內完成了檢定工作。

記者了解到，螢光定量PCR儀檢定校準過程有一套嚴格規範的流程要求，需要按照國家主管部門出臺的JJF1527-2015《聚合酶鏈反應分析儀校準規範》計量技術規範進行校準。

據陳鴻飛介紹，螢光定量PCR儀檢定主要分兩個部分，一個是溫度檢測，另一個是螢光檢測，其檢測都需要專門的設備。在溫度檢測時，計量人員使用高精度的螢光定量PCR儀專用溫度檢測設備，該設備包含15個溫度檢測探頭，能完全貼合儀器的加熱模塊，按照誤差標準，溫度檢測的不確定度要小於0.1℃。同時，螢光檢測時需要使用國家核酸標準物質，該標準物質覆蓋了（102～108）拷貝數的核酸樣本，可以全面評價螢光定量PCR儀螢光檢測性能。

「按照規範要求，目前全國已經實現建標、能夠完成螢光定量PCR儀校準的計量機構不超過10家。」據胡寧介紹，南京市計量院擁有批准建設的唯一國家級生物技術藥物產業計量測試中心，且該院和計量「國家隊」——中國計量科學研究院一直保持密切的合作，在該領域具備較強的科研和技術能力，能夠嚴格按照規範要求完成校準工作。

此次檢定校準工作由陳鴻飛和一名同事共同完成。陳鴻飛說，一臺螢光定量PCR儀螢光部分檢測需要一個半小時左右，溫度部分檢測需要半個小時左右。檢定中，他和同事對南京市疾控中心的螢光定量PCR儀溫度參數進行了修正，對螢光部分的核酸樣本偏差、樣本線性等參數給出了綜合評價，並出具了校準證書，校準工作得到了南京市疾控中心的高度肯定和認可。

「計量部門的工作，就是要通過高效快速優質的檢定校準，讓儀器更加準確、數據更加可靠、質量控制更好、更加快速地實現新冠病毒的檢測確認，為打贏疫情防控阻擊戰作出計量人的貢獻。」胡寧說。

《中國質量報》