近期發現一個有趣的現象，很多老師秉承著一個觀念，就是敲除實驗裡的細胞沒必要做到單克隆，只要蛋白水平有敲低效果就可以完成實驗。
聽起來這的確是個省時省力的好方法，但是細細琢磨下來又似乎存在著一些弊端。要知道，這個方法的可行性建立在100%確保最終細胞會有敲低效果的基礎上，只是結果會呈現出或多或少的差異。而實際上，這一太過理想化的構思卻會面臨諸多現實問題，下面將用實驗數據為您一一分析。
就算是同株來源，我和你也不一樣
F老師想用一株自有細胞系做敲除株，最終鑑定敲除株目的蛋白的敲低效果。考慮到細胞可能存在異質化，在進行敲除實驗之前我們對該野生型細胞株先進行了單克隆化處理，並隨機篩選了10株單克隆進行RT-qPCR驗證。
結果表明，不同單克隆的目的基因其表達水平相差很大，最高的表達效率是原始細胞株的近10倍，而最低的則是原始株的3.50%，兩者之間的表達效率相差將近300倍。
「死灰復燃」的蛋白表達
M老師與F老師有著大致相同的敲除實驗方案和實驗訴求，不同的是，M老師並沒有打算做到單克隆這一步。轉染藥篩細胞後，他用野生型與Mixclone進行了RT-qPCR驗證，結果顯示有明顯的表達量降低。
M老師認為，該結果也可以在WesternBlot中完美呈現，但事與願違，幾乎沒有任何敲低效果。經建議M老師同意進一步單克隆化，經過篩選，最終獲得了一株敲低效果顯著的單克隆敲除株。
「穩定+高效」才是魚和熊掌兼可得
讀到此處的你或許會說，我當然也知道單克隆細胞株的優勢，也希望能一次性獲得好幾株單克隆細胞株，讓我篩選效果最佳的。
可是單克隆化的過程總是會遇到諸多困難，就只能放棄了，聽別人說單克隆化沒必要，只要細胞株在蛋白水平有敲低效果就行，我也照著做好了。然而大量的實驗數據證明，不如意的結果，往往可能就是因為這一點「沒必要」造成的。
高效地實現單克隆化
傳統的單克隆化方法，主要有極限稀釋法和克隆環法：
極限稀釋法是通過細胞計數將細胞稀釋至極限，以單個細胞的方式接種至96孔板中培養獲得克隆的方式；然而這種方法培養周期長，會消耗大量耗材和試劑成本，結果往往也不盡如人意，如獲得的克隆樣本數不多，邊緣效應導致細胞死亡等。
克隆環法是將數以百計的細胞接種於培養器皿中培養2周，單個細胞會在局域增殖形成克隆集落，使用克隆環對集落進行標定，消化並接種至96孔板中。這種方式培養周期也較長，並且要求實驗人員有很強的無菌操作技能。
ClonePlus技術
我們從傳統方法中不斷吸取經驗摒棄不足，Cas9X海星生物技術平臺研發出了ClonePlus技術。該技術是專有高效的細胞敲除技術，主要通過高通量電轉系統和高通量的克隆分選技術結合，獲得基因編輯的單細胞，其克隆形成率可以達98%，就算是克隆形成率低的細胞株也能獲得敲除單克隆，7-10天可以完成絕大部分的細胞的單克隆工作。
基因組穩定的單克隆化細胞株，通過篩選獲得的高效表達，「穩定+高效」，魚和熊掌兼可得。Cas9X技術團隊致力於將實驗中的每個細節都做到極致，力求精準而不是做無用功，讓您的每分耕耘皆有收穫。
以上內容由海星生物提供
公眾號：Cas9X細胞基因編輯