2020年5月23日訊/
生物谷BIOON/---由SARS-CoV-2病毒引起的COVID-19大流行已成為一場人道主義危機，截至2020年4月8日報告的感染人數超過150萬，死亡人數超過8.7萬，到2020年4月27日已迅速增加到感染人數超過299萬和死亡人數20.7萬。SARS-CoV-2與嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒（SARS-CoV）和β冠狀病毒家族中的幾個成員（包括蝙蝠冠狀病毒和穿山甲冠狀病毒）密切相關。可能是由於SARS-CoV-2病毒刺突蛋白與宿主受體的結合親和力較強，SARS-CoV-2在人與人之間的傳播率要高得多，從而導致全球範圍內的感染。
SARS-CoV-2是一種正鏈RNA病毒。它的複製是由病毒非結構蛋白（nsp）的多亞基複製/轉錄複合物介導的。這種複合物的核心成分是RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）的催化亞基（nsp12）。nsp12本身幾乎沒有什麼活性，其功能需要包括nsp7和nsp8在內的輔助因子，這些輔助因子可以增加RdRp的模板結合和持續合成能力。RdRp也被提出是一類稱為核苷酸類似物的抗病毒藥物---包括瑞德西韋（remdesivir, 也稱為GS-5734）---的靶點，其中瑞德西韋是一種前體藥物，在細胞內可轉化為三磷酸形式的活性藥物。因此，RdRp一直是結構生物學研究的重點。科學家們已解析出nsp7、nsp8以及nsp12-nsp7-nsp8複合物的結構，並提供了RdRp複合物的整體結構。然而，由於沒有SARS-CoV-2 RdRp與RNA模板或核苷酸抑制劑所形成的複合物的結構，藥物發現工作受到阻礙。
在一項新的研究中，來自中國科學院、浙江大學、清華大學、北京協和醫院、無錫佰翱得生物科學有限公司、上海交通大學和浙江省免疫與炎症疾病重點實驗室的研究人員解析出SARS-CoV-2 RdRp複合物在apo形式（apo form）下以及與模板-引物RNA和抗病毒藥物瑞德西韋（Remdesivir）結合在一起時的兩種低溫電鏡結構。相關研究結果近期發表在Science期刊上，論文標題為「Structural basis for inhibition of the RNA-dependent RNA polymerase from SARS-CoV-2 by remdesivir」。
為了開展低溫電鏡研究，這些研究人員將nsp12與nsp7和nsp8在昆蟲細胞中共表達，從而形成核心RdRp複合物（圖1A）。nsp7和nsp8的化學計量比似乎小於nsp12，因此，在最後的純化步驟之前，補充了額外的
細菌表達的nsp7和nsp8，以提高異源三聚體複合物的產量。純化的nsp12在與長50個鹼基的部分雙鏈模板-引物RNA的結合上表現出很小的活性（圖1B），這與SARS-CoV的nsp12相類似。nsp7和nsp8的存在顯著增加了nsp12與模板-引物RNA的結合。在加入三磷酸腺苷（ATP）後，nsp12-nsp7-nsp8複合物在聚尿嘧啶模板上也表現出RNA聚合活性（圖1，B和C）。這種RNA聚合活性可被加入的瑞德西韋的活性三磷酸形式（triphosphate form of Remdesivir, RTP）有效抑制（圖1D）。即使在10 mM ATP的存在下，1 mM RTP也完全抑制了RdRp的聚合活性。相比之下，作為一種前體藥物，瑞德西韋在5 mM濃度下，對這種純化的RdRp酶的聚合活性沒有任何抑制作用，瑞德西韋的單磷酸形式（Remdesivir in its monophosphate form, RMP）也沒有這種抑制能力。
圖1.nsp12-nsp-7-nsp8 RdRp活性複合物的組裝以及瑞德西韋對它的抑制作用。
純化的RdRp複合物在53℃的解鏈溫度下相對穩定。nsp12-nsp7-nsp8複合物的陰性染色電鏡可視化觀察顯示出具有良好均勻性的分散顆粒。對於apo形式下的nsp12-nsp7-nsp8複合物，這些研究人員在洗滌劑DDM的存在下，對這種複合物樣本進行了玻璃化處理。對圖像處理的初步嘗試顯示，這些顆粒是優先取向的。因此，他們收集了超過570萬個顆粒的7400多個顯微影像，以增加非優先取向的投影數量。其中，81494個顆粒被用於產生2.8埃解析度的密度圖。
nsp12-nsp7-nsp8與模板-引物RNA和RTP結合在一起（稱為template-RTP RdRp複合物）時的低溫電鏡研究面臨兩個挑戰。首先，大多數顆粒被吸附到低溫電鏡網柵條上，而不是停留在玻璃態冰中。其次，在低溫電鏡樣本製備的條件下，RNA雙鏈可能從template-RTP RdRp複合物中解離下來。最終，這些研究人員製備出15mg/ml的template-RTP RdRp複合物樣本用於低溫電鏡實驗，這一濃度遠高於可溶性蛋白複合物在低溫電鏡研究時所使用的正常濃度。這種template-RTP RdRp複合物的高濃度具有質量作用效應，以穩定這種RNA-蛋白複合物，並且讓過量的template-RTP RdRp複合物逃避低溫電鏡網柵條的吸收，從而進入玻璃態冰中。他們收集了2886個顯微影像，從而利用130386個顆粒投影產生了2.5埃解析度的結構。由於這種解析出的結構的相對較高的解析度，這種低溫電鏡圖清晰地顯示了這種複合物的關鍵結構特徵。
RdRp複合物在apo形式下的結構包含一個nsp12、一個nsp7和兩個nsp8，整體排列與SARS-CoV和最近解析出的SARS-CoV-2中的結構相類似（圖2，A和B）。與SARS-CoV RdRp結構不同但與最近解析出的SARS-CoV-2 RdRp結構相似的是，這種結構顯示nsp12還包含一個N末端的β-髮夾（殘基31～50）和一個延伸的套病毒RdRp相關核苷醯轉移酶結構域（NiRAN，殘基115-250），此外還有7個螺旋和3個β鏈。在NiRAN結構域之後是一個由3個螺旋和5個β鏈組成的界面結構域（殘基251-365），該界面結構域與RdRp結構域（殘基366-920）相連（圖1A和2B）。nsp12的RdRp結構域顯示出典型的杯狀右手構象，手指亞結構域（殘基397-581和殘基621-679）與拇指亞結構域（殘基819-920）形成一個封閉的環形結構（圖2，A和B）。這種封閉構象通過nsp7和nsp8的結合而變得穩定，其中一個nsp8分子位於手指亞結構域的頂部，並與界面結構域相互作用。nsp12的封閉構象可通過nsp7-nsp8異源二聚體進一步穩定化，這種異源二聚體沿著拇指-手指亞結構域界面堆積（圖2，A和B）。此外，這些研究人員能夠在由H295-C301-C306-C310和C487-H642-C645-C646組成的保守性金屬結合基序中配位兩個鋅離子（圖2C），這一點在SARS-CoV RdRp結構中也能觀察到。這些鋅離子很可能是維護RdRp結構完整性的保守結構成分。
圖2.apo形式下的nsp12-nsp-7-nsp8 RdRp複合物的低溫電鏡結構。
template-RTP RdRp複合物的結構包含一個nsp12、一個nsp7和一個nsp8（圖3，A和B）。第二個nsp8在template-RTP複合物的低溫電鏡圖中基本看不到，因此沒有包含在最終的結構模型中。此外，template-RTP RdRp結構含有位於模板鏈中的長14個鹼基的RNA，位於引物鏈中的長11個鹼基的RNA、與引物鏈共價連接在一起的抑制劑RMP（圖3，C和D），以及一個焦磷酸和三個鎂離子，這些鎂離子可能作為活性位點附近的催化離子（圖3D）。
圖3.RdRp複合物與瑞德西韋與RNA結合在一起時的低溫電鏡結構。
template-RTP RdRp複合物的整體結構與apo形式下的RdRp結構相似，nsp12處於封閉構象（圖2A和3A）。由來自模板-引物RNA的11個鹼基對形成的雙鏈RNA螺旋（圖3C和4，A至E），由手指-手掌-拇指亞結構域握著。在模板-引物RNA和nsp12之間觀察到廣泛的蛋白-RNA相互作用，共有29個來自nsp12的殘基直接參與RNA的結合（圖4E）。令人驚訝的是，儘管nsp7和nsp8這兩種蛋白是RdRp結合RNA所需要的，但是它們並不介導RNA相互作用。大多數蛋白-RNA相互作用涉及RNA磷酸-核糖骨架，許多相互作用直接發生在2′-OH基團上（圖4E），從而為區分RNA與DNA提供了基礎。nsp12與模板-引物RNA的任何鹼基對都沒有接觸，這表明序列獨立於DNA的生物鹼基對。nsp12與模板-引物RNA的任何鹼基對都沒有接觸，這表明RdRp與RNA的結合與序列無關。這與RdRp在延伸階段的酶活性不需要特定的序列這一事實是一致的。
位於引物鏈的3′端是RMP（圖3D和圖4，D和E），RMP在+1位點共價整合到引物鏈上（圖4E）。在模板鏈的+2和+3位點上的核苷酸與來自手指亞結構域背面的殘基相互作用（圖4，A和B）。儘管在複合物組裝中存在過量的RTP，但從這種複合物結構中觀察到，只有單一的RMP被組裝到引物鏈上。因此，瑞德西韋和許多核苷酸類似物前體藥物一樣，通過非專一性RNA鏈終止機制抑制病毒RdRp活性，這一機制需要瑞德西韋轉化為它的活性三磷酸形式。
圖4.RdRp複合體識別RNA。
RMP的結合位置位於催化活性位點的中心（圖3D）。作為一種單磷酸腺苷類似物，RMP與來自引物鏈的上遊鹼基形成鹼基堆積相互作用，並且與來自模板鏈的尿苷鹼基形成兩個氫鍵（圖3D）。此外，RMP還與K545和R555的側鏈發生相互作用。在結合的RMP附近有兩個鎂離子和一個焦磷酸。這兩個鎂離子與磷酸二酯骨架相互作用，它們是催化活性位點的一部分。焦磷酸位於活性位點的核苷酸進入通道的通道口，可能阻斷核苷酸三磷酸進入活性側（圖3，C和D）。
nsp12 RdRp的催化活性位點由A到G的7個保守性基序構成（圖1A和3E）。來自手掌亞結構域的基序ABCD和基序C中的SDD序列（殘基759-761）形成催化活性中心（圖3D）。D760和D761都參與了催化中心中的兩個鎂離子的配位。基序F和G位於手指亞結構域內，它們與模板鏈RNA相互作用，並引導該鏈進入活性位點（圖3E）。基序F中與+1鹼基相接觸的K545和R555側鏈與引物鏈RNA相互作用（圖3D），從而將進入的核苷酸穩定在正確的位置上進行催化。模板-引物RNA在活性位點中的的定位類似於模板-引物RNA在脊髓灰質炎病毒RdRp延伸複合物和HCV NS5B RdRp抑制複合物中的定位。參與RNA結合的殘基以及包含催化活性位點的殘基都是高度保守的，這突出了RdRp在這些不同的RNA病毒中的保守性基因組複製機制，並表明有可能開發出廣譜抗病毒抑制劑，如瑞德西韋和加利德韋（galidesivir, 也稱為BCX4430）。
結構比較發現了apo形式下的RdRp複合物和template-RTP RdRp複合物結構之間的幾個有趣的差異（圖3，E和F）。首先，nsp7向RdRp核心移動了1.5埃（如nsp7殘基F49所測得的那樣），導致界面重排，結果就是複合物中第二個nsp8的結合力減弱。第二，連接拇指亞結構域的第一螺旋和第二螺旋的環狀結構向外移動了2.8埃（如nsp12殘基I847所測得的那樣），以容納雙鏈RNA螺旋的結合（圖3F）。第三，基序G殘基K500和S501也向外移動2.0埃，以容納模板鏈RNA的結合。除了這些變化之外，apo形式下的nsp12和template-RTP RdRp複合物中的nsp12非常相似：整個蛋白中所有Cα原子的均方根偏差（root mean square deviation, rmsd）為0.52埃。特別是構成催化活性位點的結構元素可以完全疊加（圖3E），這表明SARS-CoV-2 RdRp是一種相對穩定的酶，當與RNA模板結合後，就可以發揮複製酶的功能。病毒RdRp是一種高度進行性的酶，其複製速度可達100個核苷酸/秒。apo形式下的結構和活性酶結構之間沒有明顯的構象變化，這與病毒RNA聚合酶的較高持續合成能力相一致，因而在複製周期中不需要消耗額外能量來導致活性位點發生構象變化。
除了瑞德西韋之外，一些核苷酸類似物藥物，包括法匹拉韋（Favipavirir）、利巴韋林（Ribavirin）、加利德韋（galidesivir）和EIDD-2801，在細胞實驗中有效地抑制SARS-CoV-2複製。與瑞德西韋一樣，這些核苷酸類似物也被提出通過非專一性RNA鏈終止機制抑制病毒RdRp，這種機制需要前體化合物轉化為它們的三磷酸活性形式。template-RTP RdRp複合物的結構提供了一個很好的模型來合理地思考這些藥物如何抑制SARS-CoV-2 RdRp活性。特別是，EIDD-2801在阻斷SARS-CoV-2複製方面比瑞德西韋強3～10倍。胞苷環外的N4羥基與K545的側鏈形成一個額外的氫鍵，而胞苷鹼基也與模板鏈上的鳥嘌呤鹼基形成一個額外的氫鍵。這兩個額外的氫鍵可能解釋了EIDD-2801在抑制SARS-CoV-2複製方面具有明顯更高的效力。
COVID-19大流行已經在全球範圍內造成了情感上的痛苦和經濟負擔。對病毒生命周期至關重要的酶，因其與宿主蛋白不同，是很好的抗病毒藥物靶點。在病毒酶中，RdRp是現有許多核苷酸類藥物的主要靶點。在這篇論文中，這些研究人員報導了SARS-CoV-2 RdRp複合物的apo形式以及與模板-引物RNA和活性形式的雷德西韋結合在一起時的結構。這些結構揭示了模板-引物RNA是如何被這種酶識別的，以及瑞德西韋如何抑制鏈的延伸。結構比較和序列比對表明，RdRp識別底物RNA和瑞德西韋抑制RdRp的模式在不同的RNA病毒中高度保守，這為設計基於核苷酸類似物的廣譜抗病毒藥物提供了基礎。此外，這些結構為現有的核苷酸類藥物（包括強效的EIDD-2801）的建模和修飾提供了一個堅實的模板。總之，這些觀察結果為設計更強效的抑制劑來對抗SARS-CoV-2的惡性感染提供了合理的基礎。（生物谷 Bioon.com）
參考資料：Wanchao Yin et al. Structural basis for inhibition of the RNA-dependent RNA polymerase from SARS-CoV-2 by remdesivir. Science, 2020, doi:10.1126/science.abc1560.