文章題目：Temporal expression of MOF acetyltransferase primes transcription factor networks for erythroid fate
期刊：Science Advances
發表時間：2020年5月20日
DOI:10.1126/sciadv.aaz4815
造血幹細胞（HSCs）的自我更新和分化受轉錄因子和表觀遺傳調節因子的精細調控。這裡，作者探索了組蛋白H4賴氨酸16乙醯轉移酶MOF調節紅細胞生成的機制。單細胞RNA測序和染色質免疫沉澱測序發現MOF通過動態募集染色質來影響紅系發育軌跡，其單倍劑量不足會導致短期的HSC細胞群積聚。由MOF，RUNX1和GFI1B組成的調控網絡對於紅系命運至關重要。GFI1B充當Mof激活劑，它的表達對於特異性細胞誘導Mof表達是必需和定量的。Mof耗盡HSCs的可塑性可以通過下遊效應Gata1的表達或通過組蛋白去乙醯基酶抑制劑的重塑乙醯化平衡來挽救。Mof表達的準確時機和劑量可充當前饋轉錄因子網絡的變阻劑，從而保證沿紅系命運的發展。
樣本數據已發表數據：
published transcriptome-wide data（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7314555/#R18）
Chromatin accessibility analysis from human hematopoietic cells (ATAC-seq)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7314555/#R27)
bulk (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7314555/#R37)) and single-cell ATAC-seq (scATAC-seq) of hematopoietic cells (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7314555/).
published GFI1B ChIP-seq profiles (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7314555/#R40).
此研究產生數據：
Mouse strains：Eight- to 12-week-old mice from both sexes were randomly allocated to experimental groups. Ten-week-old male animals were used for ChIP-seq, RNA-seq, and scRNA-seq
Cell culture：HPC7 (murine hematopoietic progenitor cell line CVCL_RB19)， K562 cells (human blood from chronic myelogenous leukemia CVCL_004) and Wehi-3 (Mus musculus monocytic leukemia, CVCL_3622) cells
scRNA-seq experiments on FACS（Fluorescence-activated cell sorting）-sorted progenitor cells
ATAC-see (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7314555/#R26)
ChIP-seq profiles from primary HSCs (15,000 cells; LSK+CD34−Flt3−) and MEPs (30,000 cells)
數據分析fate-bias probabilities from c-Kit+ cells data from組蛋白乙醯化是由KATS和組蛋白去乙醯酶（HDACs）控制，其中，一個超乙醯狀態通常會導致染色質解體 。為了調查哪些KATS和HDACs可能被紅系生成過程中觀察到的動態表達基因調控，作者分析了已發表的轉錄組數據。大多數酶（例如Tip60，Ep300或Sirt1）在整個類紅細胞軌跡中都穩定表達，但作者觀察到Mof表達是動態的（圖1A）。作者還評估了c-Kit +細胞的紅系，髓系和淋巴的命運偏向概率數據來自 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7314555/#R12），與Mof表達有關（圖S1，A和B）。與已知的紅細胞標記（例如Gata1，Kfl1，Gypa，Hbaa1和Alas2）相似，表達Mof的細胞與紅系或淋巴細胞相比，沿紅系譜系發展的傾向更高（圖1B）。
圖1 ABCD接下來，作者們要確定Mof的喪失是否會影響紅細胞生成。然而構建Mof的基因敲除（KO）小鼠模型具有胚胎致死性，但Mof雜合子（Mof+/-）小鼠是可行的，並且沒有表現出明顯的表型或壽命改變。雜合動物的造血祖細胞顯示Mof 的mRNA降低60％（圖S1C），MOF蛋白大量（圖S1D）和H4K16ac水平降低（圖S1E）。作者發現Mof +/-小鼠顯示出低的RBC和血紅蛋白（HB）以及血細胞比容（HCT）水平（圖1C），所以將它判定為貧血。為了查明有缺陷血液形成的起源，作者們對Mof +/-小鼠（圖S2和注釋S1）的骨髓（BM）的細胞庫進行了廣泛表徵，並使用條件性Vav1-iCre Mof-KO 模型獨立驗證了表型（圖S3，A至F和注釋S1）。Mof +/-動物顯示出紅系祖細胞和MEP的顯著減少（圖S2B），同時髓系祖細胞的數量增加（圖S2B）。這些小鼠還會積聚具有形態缺陷的RBCs，並且網織紅細胞的百分比增加（圖S2，C至F）。然而，這些變化並沒有伴隨BM總細胞數和在-c-Kit+細胞的血數量上表現任何顯著差異。此外，作者也沒有觀察到脾臟質量和細胞性的任何重大變化，以及紅系細胞中細胞凋亡頻率或細胞周期異常的差異。然而，紅系細胞明顯減少，並且作者檢測到外周嗜中性粒細胞數量增加（圖S2，G至M）。總體而言，這些分析表明Mof含量的降低會導致紅系發育受損，並伴有髓樣傾斜。
MOF存在在兩種不同的染色質修飾複合物中，即非特異性致死（NSL；哺乳動物中為KANSL）複合物和雄性特異性致死（MSL）複合物。在哺乳動物中的MSL複合物，MOF參與了發育基因的精細調控。但是，在MSL3中具有功能喪失突變的人類個體未顯示血細胞缺陷。因此，作者懷疑MOF作為KANSL複合體的一部分在紅細胞生成過程中發揮其功能。作者生成了條件性的Kansl2和Kansl3 KO小鼠在刪除Vav1-iCre基礎上，並表徵了它們的血液成分（有關詳細信息，請參見注釋S1和圖S3，G至O）。兩種突變體均顯示出類紅系細胞發育的缺陷。Vav1- iCre / Kansl2 KO小鼠與Mof +/-小鼠更相似，因為它們也具有正常的壽命，但在體內（圖S3，H和I）和體外（圖 S3，J和K））的紅系祖細胞和RBC明顯減少。此外，亞致死量照射的野生型小鼠接受200 VAV1 -iCre / Kansl2 KO HSCs的過繼轉移（LSK + CD34 -的Flt3 - CD48 + CD150 +）也顯示受損的紅細胞生成（圖S3L）。相反，Vav1- iCre /Kansl3 KO觸發了更強的表型，其特徵是胚胎致死和胎兒肝臟紅系祖細胞的喪失，特別是在晚期紅系分化中（圖S3，M至O）。與Mof相反，Kansl2和Kansl3條件性KOs並未顯示粒細胞增加（圖S3I），這意味著在Mof +/-動物中發現的髓樣偏見可能源於KANSL獨立功能。
圖1 EGHF基於Mof沿紅系分支的兩個表達峰（圖1A），作者有興趣進一步探討貧血表型是否由HSCs，祖細胞和定型細胞中的功能引起。作者首先測試了Mof丟失是否會影響HSC參與紅系譜系的內在能力。作者們將來自野生型或Mof +/-小鼠的單個HSCs分類到液體培養孔中，其中含有支持髓樣，紅系和淋巴樣分化、單細胞集落形成單位（sc-CFU）的細胞因子。作者通過螢光激活細胞分選（FACS）檢測了219個單克隆輸出（72個野生型和147個Mof +/-），以檢測髓樣（c-Kit − CD11b +），紅系（c-Kit − Ter119 +）和淋巴樣分化c-Kit − IgD + ; B細胞群體，因為這些條件缺乏T細胞引發所需的細胞間相互作用。培養10天後，作者沒有觀察到集落強度的差異，因為野生型和Mof +/- HSCs均可產生多能（全部三個種群），雙能（兩個種群）和寡聚（僅一個種群）集落，每個集落大小和總細胞數相似（圖1，D和E）。但是，作者發現產生細胞偏斜，其中Mof +/- HSCs產生明顯更多的髓樣細胞和較少的紅系細胞，而B細胞數量保持不變（圖1F）。為了進一步驗證這些HSCs的增殖和分化能力，作者進行了bulk CFU分析，其中將100來自野生型或Mof +/-小鼠的FACS分選的HSCs接種在補充細胞生長因子的甲基纖維素基培養基中,它維持兩種類型的紅系祖細胞[爆發形成單位紅系（BFU-E）和CFU-E]、巨噬細胞（GM）祖細胞（CFU-GM）、單核細胞、巨核細胞集落（CFU-GEMM）的形成。與sc-CFU分析中獲得的結果一致（圖1，D和E）作者在bulk CFU實驗中觀察到Mof+/- HSCs中BFU-E數量減少，CFU-GM數量增加（圖1G）。
由於雜合動物中Mof的終生耗竭可能會引起繼發效應或導致第二反應其可能混淆作者分析細胞表面標誌物表達變化，因此作者使用誘導型小鼠模型（Cag-CreERT2 T / + ; Mof fl / fl）驗證結論，其中僅在培養物中進行4-羥基他莫昔芬（4-OHT）處理後才刪除Mof（稱為Mof -iKO）。在HSCs中誘導通過4-OHT處理Mof* KO導致髓樣菌落數量增加而紅系集落數量減少（圖1H），概括了Mof +/- HSCs中觀察到的表型。作者觀察到Mof +/- HSCs在CFU-GEMM中顯示出明顯的減少，而在Mof -iKO小鼠中卻沒有那麼明顯，表明這可能是次要的作用。接下來，作者從Mof +/-和Mof -iKO HSCs進行了連續培養CFU分析。該分析表明，儘管Mof +/- HSCs在重培養後仍保持對髓樣命運的偏向，但Mof -iKO HSCs形成的總體菌落明顯少於對照（圖1I），這表明Mof KO完全破壞了HSC的自我更新能力。
圖1 IJK考慮到Mof +/-小鼠不僅顯示出早期紅系分化的缺陷，而且還顯示出受損的晚期紅系分化的跡象（圖S2，C至I和注釋S1），與晚期相比，作者研究了HSCs中Mof降低的後果。為此，作者首先對來自野生型和MOF +/-動物中MEPs的進行CFU分析試驗（Lin−cKithighSca-1−CD34−FcγgII/III−），評價在培養中他們的集落形成的能力。
來自Mof +/-動物的MEP（分化過程中MOF長期發生變化）顯示出CFU-E和BFU-E集落（來自Mof +/- MEPs）明顯減少（圖1J）。為了了解Mof缺失在已定型的紅系細胞/巨核細胞祖細胞中的後果，作者們對MEP進行分選，並在分選後並進行體外4-OHT處理然後分析CFU細胞。當作者們使用Mof-iKO模型時，獲得了不同的結果，在該模型中，已經啟動的祖細胞（MEPs）中的Mof既不影響CFU-E也不影響BFU-E的形成（圖1K）。這些數據支持「Mof的功能在紅細胞生成的早期階段和觀察到的終末分化很重要」的想法。
為了分析體內HSC譜系啟動，作者進行了Mof +/- HSCs的移植。移植後八周，作者觀察到脾臟大小明顯增加（圖S4A），儘管作者未觀察到細胞死亡的總體差異，但注意到明顯的粒細胞失衡，其特徵是淋巴樣數量減少且髓樣細胞數量增加（圖S4，B和C）。與野生型受體脾相反，Mof +/-受體脾未能恢復其組織結構，其中作者觀察到了毛囊結構缺陷和紅系細胞的總體減少（圖S4D）。此外，根據其Mof +/-基因型，移植的細胞（CD45.2 +）顯示出H4K16ac水平降低（圖S4E）。Mof +/-受體小鼠表現出脾臟紅系祖細胞的頻率降低，而循環成熟RBC顯著降低（圖S4，F和G）。總的來說，這些數據表明脾臟腫塊的增加可能反映了髓樣的擴張。
接下來，作者檢查到Mof +/-受體動物BM 中CD45.2 +細胞嚴重減少（圖S4H）。HSPCs中的進一步聚集顯示常駐HSCs數量增加，MPPs減少（圖S4，I和J）。為了探索HSC的自我更新和分化能力，作者接下來進行了BM二次移植。Mof + /-第二受體由於嚴重貧血而過早死亡（圖S4，K和L）。該結果還表明，在重複性挑戰下Mof +/- HSC可能會損害自我更新，如在CFU系列培養實驗中針對Mof -iKO所述（圖1I）。
這些數據一起表明，Mof的一個等位基因的喪失會以細胞內在的方式幹擾HSC譜系定型，而優先選擇粒細胞/髓系譜系，而以犧牲紅系譜係為代價。此外，作者發現譜系定型後刪除Mof，即在MEP中，不會導致紅系集落形成缺陷。
Mof +/-動物中由於擾動的紅系程序而導致轉移狀態祖細胞的積累為了理解體內受損紅系譜系定型，作者利用FACS從野生型和MOF + / -小鼠的祖細胞分選進行scRNA-SEQ實驗792 LT-HSC，576 LSKhighCD34 -Flt3 -，864 LSKhigh， 576 LSK low ，768 cKit high，48個巨核細胞祖細胞，24個粒細胞/巨噬細胞祖細胞（pre-GMP），24個粒細胞/巨噬細胞祖細胞（GMP），48個pre-Meg-E，48個pre-CFU-E，48個MEP ，以及24 Pro-E]（圖S5，A和B，請參見材料和方法）。使用活性染料來確保僅對活細胞進行了分選。應用了RaceID根據基因表達生成聚類（圖S5，C和D），並使用各種方法（包括已知標記基因的表達和轉錄組熵）驗證聚類圖（圖2，A至C和圖S5，E和F）。作者觀察到Mof +/-紅系中紅系程序的明顯失調，例如在MEP（cluster 6） 中的 Gata2，Hbb-bt，Hba-a1，Trib2，Aqp1和在紅細胞中的Mpo，Car-1，Car-2，和Hba-a1（cluster 3）（圖2D）。
圖2 AB圖2 CD接下來，作者使用FateID 探索細胞命運如何在Mof +/- 細胞中受到幹擾以及如何形成命運偏向（圖2E和圖S5，G和H）。這些分析證實，與表達其他KAT的細胞相比，表達Mof的 細胞具有更高的的可能性成為紅系細胞（圖S5G）。接下來，作者定義了兩個不同的軌跡終點（GMP，cluster 8；紅系細胞，cluster 3），並提取了其他祖細胞群中所有細胞或dHSC分化為這兩個終點的概率。這表明與GMP譜系相比，Mof +/- 細胞遵循紅系譜系的可能性要低得多（圖2E和圖S5H）。與較低的紅系細胞分化的預測一致，作者觀察到Mof +/- 小鼠的BM中紅系細胞數量減少（圖2F），儘管觀察到這些動物的BM細胞沒有明顯變化（圖S2B）。紅系細胞的減少與細胞凋亡增加或增殖減少無關（圖S5I）。但是，這與有缺陷的紅系細胞程序一致，因為作者觀察到分選的MEP中Gata1-Pu.1 平衡發生了變化（圖S5J），因此驗證了作者的scRNA-seq結果。
圖2 FG作者根據基因型進行t-SNE圖進行聚類，並在dHSCs（cluster 2）和MPPs（cluster 4）中檢測到野生型的細胞多於Mof +/- 型細胞，而在其他情況下Mof* +/-細胞多於野生型細胞（cluster 10）（圖2G並注意S2）。作者通過FACS證實了這一點，觀察到HSCs升高，但Mof +/- BM中MPP2（圖S6A）的數量顯著減少，而細胞死亡數沒有改變（HSC到MPP4），活性氧（ROS）的產生（ HSCs）或細胞周期（LSK +）沒有變化（圖S6，B至D）。考慮到Mof +/- HSCs不易形成紅系細胞集落（圖1，E和H），作者懷疑cluster 10 中積累的細胞可能是分化受損的結果。
作者對此細胞群感興趣，更廣泛地描述了其特徵（圖S6，E至L和注S2）。檢測到典型的dHSC表達模式，例如Myc和Tal1網絡的調節減少，Erg和Hoxa9網絡激活，以及與各自的分子重疊強相關性MoLO基因和高視黃酸模式。cluster 10還同時顯示了aHSC的特徵，例如Meis1，Cdk4，Cdk6和活躍的Stat1途徑的表達。考慮到主動功能和dHSC功能的呈現，作者假設Mof+/- HSC代表中間HSC狀態。總之，分析表明，正確執行紅系分化程序需要祖細胞中MOF作用。
紅系生成過程中MOF介導的染色質可及性動力學接下來，作者試圖研究MOF調控紅系程序的分子機制。由於MOF會沉積H4K16ac，在體外這直接影響染色質可及性，因此作者使用可視化的轉座酶可及染色質（ATAC-see）分析研究了沿紅系生成的染色質緊縮。簡而言之，該方法允許通過轉座酶輔助原位成像以單細胞解析度可視化可及基因組。作者通過FACS和顯微鏡分析了ATAC-see信號（圖3，A和B）（圖3C和圖。S7，A和B）。總體而言，這些數據表明Mof +/- 動物在HSCs（LSK + CD34 - CD150 +），MPP（LSK + CD34 +）和MEP（Lin - Sca-1 - cKit高CD34 - FcgRII ）中顯示出總染色質可及性的顯著降低。/ III - ），而不是的GMPs（林-的Sca-1 -的cKit高CD34 - FcgRII / III高），它支持細胞類型特異性功能。
圖3 ABC作者的ATAC-seq數據揭示了野生型細胞中沿紅系分化過程的染色質可及性的全局變化。當作者重新分析來自已發布的人類ATAC-seq數據時，作者也注意到，HSC和MEP的可及區域數量比MPP和紅系細胞（圖3D高。與此相符，作者在他們的數據中發現HSC，MEP和MPP2中H4K16ac的水平顯著增加（圖3E)和 fig. S7C）。總的來說，這些數據表明H4K16ac和體內整體染色質可及性之間存在直接聯繫。
圖3 DEF因此作者詢問Mof本身的表達變化是否反映了染色質可及性的這種動態模式。為此，作者對HSCs進行了分類，並進行了CFU分析，並在第0天（細胞分選後），5天和10天收集了RNA。作者觀察到野生型細胞中Mof RNA的水平遵循與已發表的和作者自己的體內全基因組數據相同的動態模式（Figs. 3F and and1A and fig. S9A)。與野生型細胞相比，源自Mof +/- HSC的集落特徵是最初的Mof水平較低，隨後在5天時異常增加Mof RNA，然後在基於甲基纖維素的培養基中10天後再次降低（圖3F）。Mof RNA的這些波動反映體內染色質可及性和H4K16ac的動力學，作者在Mof +/-共同髓樣祖細胞（CMPs）中通過ATAC-see觀察到的染色質可及性峰值和較高的H4K16ac水平(Figs. 3, B and E）。這些數據表明，紅系生成缺陷不僅出現在Mof表達缺失下，還受其表達時間幹擾(例e.g., Mof+/− mice)。為了驗證這些變化是由MOF的細胞內在功能引起的，作者在Mof- iKO HSC中重複進行了ATAC-seq(Fig. 3, G and H)，該結果概括了Mof +/-小鼠中的早期結論。一起表明沿紅系生成的全面染色質可及性動力學是由MOF介導的H4K16ac沉積決定的。
fig3 GHHSCs和MEPs中不同的MOF全基因組結合譜為了評估MOF如何指導造血譜系承諾，作者接下來從野生型和Mof +/-動物型分離了原代HSCs（15,000個細胞; LSK + CD34 − Flt3 −）和MEP（30,000個細胞）產生ChIP-seq譜（圖 S8A）。經過質量控制評估（FastQC）之後，作者找出了peaks並在HSCs中確定了20,096個MOF結合區域（請參見補充數據）和在MEPs中確定了25,521個MOF結合區域（請參見補充數據），其中分別有16,924和6817結合在轉錄起始位點（TSS）附近(圖4A和圖S8，B和C)。作者不僅觀察到動態結合（cluster 1，HSC> MEP；cluster 2，HSC <MEP），而且觀察到細胞類型不變的峰（cluster 3；圖4B）。驗證作者找出peak的特異性，MOF ChIP-seq信號在Mof +/- HSC中整體降低，但是這種效應在細胞類型特cluster 1中最為明顯（圖S8，D和E）。作為補充數據集，作者在造血前體細胞7（HPC7）中生成了MOF和H4K16ac ChIP-seq圖譜。這些數據與HSC數據高度吻合，並進一步證實了MOF和H4K16ac在特定於細胞類型的靶位點上的特定重疊，而其他KATs不存在（圖4C）。
圖4 ABC為了驗證MOF結合區域是否受到影響，作者評估了它們在scRNA-seq數據集中的表達。與MOF介導的組蛋白乙醯化的激活作用一致，作者觀察到的MOF-結合基因的RNA水平，但不是隨機對照基因，整體上在MOF+/-造血幹細胞（scRNA-SEQ，cluster 2和5）和MEPs（scRNA-seq，cluster 6）顯著降低，但沒有在MPPs降低（scRNA-seq，cluster 4）（圖4D）。此外，HSC特異性MOF靶標（cluster 1）（例如Runx1和Fos）示例顯示，在分選的Mof +/- HSC（LSK + CD34 - Flt3 - CD48 - CD150 +）中RNA含量降低了（圖4E和圖S8F），而在Mof +/-細胞（例如Cdk8）的仍結合區域中未觀察到RNA水平變化（圖4E）。
圖4 DEF接下來，作者有興趣了解差異ChIP clusters中哪些生物學過程與MOF結合的基因相關聯，然後進行了GO分析。在HSC中特異富集但不在MEP中富集的靶標（cluster 1 ）似乎富集了與HSC分化相關的術語（圖S8G），例如，細胞骨架變化和TF結合。因此，cluster 1 TF 靶基因，諸如細胞命運承諾和細胞分化等生物過程有關被富集（圖S8G）。另一方面，cluster 2 MOF peaks（MEPs> HSCs；圖S8H）在「核心啟動子序列特異性DNA結合」等術語上得到了特異富集。這反映在各自的TF靶標富集中，揭示了「紅細胞分化」和「 RUNX1調節基因」。MOF與HSC中的Runx1啟動子結合後，進一步加強了MOF與Runx1之間的聯繫（圖4E）。總之，這些分析表明，細胞類型特異性MOF靶標的大部分是HSC和MEP中的TF基因。
為了進一步描述與MOF合作的TF網絡，作者執行了TF親和力預測TRAP;分析MOF峰（圖4F）。除了在兩個集群中富含AT的基序，所述細胞類型特異性cluster 1的peaks顯著富集到Elf5和Runx1的基序，其作為TFs參與HSC分化。在Cluster 2中，作者發現富集motifs為已知的紅系調節子GATA1和ARID3A。
接下來，作者著手驗證MOF結合與ATAC-see所觀察到的染色質可及性變化之間的聯繫，請參閱（圖3，A到D）。為此，作者分析了造血細胞的bulk 和單細胞ATAC-seq（scATAC-seq）。在兩個數據集中的開放區域內都發現了MOF peak的大量富集。在顯示平均相似表達水平的基因對照組中未觀察到這一點，這表明可及性並非簡單地由基因活性本身驅動，而是與MOF存在相關（圖4，G和H）。這表明受MOF綁定區域佔了HSCs和MEPs中大多數可訪問區域。
fig4 GHL上面的結果促使作者研究MOF在HSCs和MEPs中可及區域是否特別富集到紅系軌跡（圖S8I，另請參見材料和方法）。為此，作者使用了基於DNA motif的方法，從對已發布的scATAC-seq數據進行偽時間分析開始。作者沿紅系軌跡從每個細胞中可及的位點提取了k-mer 信息flanking 7 bp of scATAC-seq peak，如STREAM（39(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7314555/#R39 圖4I）。接下來，作者從HSCs和MEPs中的每個MOF ChIP-seq TSS峰中提取了 k-mer 信息。然後，作者查看兩組（HSCs或MEPs）中獲得的MOF-peak k-mers 是否在給定群軌跡的可訪問位置和特徵處顯著富集。HSC-MOF k-mers 被特異富集在HSC-MPP軌跡的可及基序（圖4J）。MEP-MOF k-mers，相反，更致力於MPP-MEP細胞軌跡增加(圖4K）。作者的分析表明，細胞類型特異性MOF k-mers 在HSC-MPP和MPP-MEP擬軌跡中大量富集（圖4，J到L）。
圖4 JK總之，作者分析表明，HSC和MEP中的MOF結合位點與這些階段的開放染色質區域相關。這種由MOF介導的染色質可及性決定了紅系細胞的命運。
GFI1B對Mof表達的細胞特異性調控考慮到MOF沿紅系軌跡的動態表達和全基因組範圍的佔用，作者預測Mof基因本身受譜系特異性TFs動態控制。因此，作者接下來將注意力集中在Mof啟動子的調控上。作者在小鼠和人類Mof啟動子中進行了單個基序佔用預測，並確定了TF GFI1B的兩個連續基序的保守富集（圖5A）。在已發布的GFI1B ChIP-seq資料中，GFI1B似乎富含在HPC7細胞的Mof啟動子區域（圖5B）。由於Gfi1b是RUNX1的直接下遊靶，它本身就是一個MOF目標，作者推測轉錄因子Runx1的和Gfi1b參加與循環監管MOF是逐步觸發紅系命運承諾。為了驗證針對這些因素的靶向性，作者在HPC7細胞中進行了ChIP定量聚合酶鏈反應（qPCR）實驗，該實驗可再現證實RUNX1與Gfi1b啟動子結合和GFI1B與Mof啟動子的結合（圖5C）。
Fig5 ABCDEMof mRNA水平在紅細胞生成過程中顯示兩個峰值（圖3F）。scRNA-SEQ數據集揭露了在體內第一個表達峰值MOF與Runx1 的表達重合，第二個具有增加Gfi1b 水平（圖S9A）。此外，Mof +/- 動物還顯示Runx1 和Gfi1b的調控異常（Figs. 4E and 5D and fig. S9A）。調查MOF 表達是否需要Gfi1b ，作者在HPC7細胞中進行小幹擾RNA（siRNA）調低（KD的）Gfi1b，其通過免疫螢光顯示其有著顯著降低的MOF水平（圖5E）。為了進一步剖析這一機制，作者接下來進行了螢光素酶報告基因檢測，以比較野生型Mof 啟動子和突變的Mof 啟動子，其中39bp GFI1B結合區被改寫（圖5F）。該測定法在HPC7細胞（較幼稚的狀態）和K562細胞（較紅系定型的細胞）中進行。作者觀察到HPC7和K562細胞中明顯的Mof 啟動子活性，該活性在GFI1B結合位點突變或Gfi1b KD完全消失。當在K562細胞中異位表達Gfi1b 時，該報告基因構建物的活性得以增強，而在HPC7細胞中，這種作用相當微妙。此外，GFI1B對Mof 啟動子的這種調節似乎具有高度的細胞類型特異性，因為作者到外周血單核細胞（Wehi3）或人胚胎腎（HEK）293T（非造血起源）中啟動子突變後沒有觀察螢光素酶活性的降低。
圖5 F為了探索Runx1和Gfi1b對紅細胞生成的功能相關性，作者將細胞分選為Runx1 KD或Gfi1b KD HSCs（LSK + CD34 - Flt3 - CD48 - CD150 +）單細胞放入基於甲基纖維素的預塗孔中（圖5G）。培養10天後，作者觀察到Gfi1b KD HSCs集落形成明顯減少。HSCs中的Runx1 KD導致BFU-E能力受損，但能夠維持CFU-GM的形成（圖5，H和I）。與作者先前的觀察結果一致，Gfi1b KD導致Mof表達降低。反過來，Runx1 KD導致Mof和Gfi1b水平降低（圖5J）。總體而言，這些數據強烈支持「通過與Mof其啟動子的直接結合，GFI1B調節Mof發揮積極作用」。因此，Gfi1b和Runx1共同參與一個調節網絡，控制著對紅細胞生成至關重要的染色質可及性調節劑（MOF）的表達。總的來說，作者發現譜系特異性TF和MOF介導的組蛋白乙醯化的順序作用有助於紅系的命運。
圖5 GHIfig5 J通過乙醯化再平衡和強制紅系命運挽救異常的紅系軌跡圖6 ABC鑑於這些複雜且準確定時的事件，作者想進一步了解Mof 如何調節紅細胞生成過程中的表達動態。因此，作者對scRNA-seq數據進行了偽時間分析。發現了紅系命運最高概率cluster 3（紅細胞）群（圖6A， 圖S9B，以及材料和方法）。使用該簇作為終點，作者計算了命運偏倚，並從主分化曲線中提取了屬於紅系軌跡的細胞。參見25(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7314555/#R25 。總共分選了264個野生型細胞和215個Mof +/-細胞，並分析了沿紅系軌跡的14,279個基因的表達。具有相似表達模式的基因被聚集到同個節點中（Pearson相關係數，> 0.85；基因/節點列表在補充數據中提供）。這項分析使作者能夠確定沿軌跡的基因表達活動的時間。總體而言，作者發現Mof +/- 動物與野生型的基因表達模式相比存在顯著差異（圖6B）。例如，正常情況下，節點1至16中共有3449個基因在早期階段表達，但在Mof +/- 動物中，它們在偽時間晚得多（圖6，B和C）。通常在Mof 單倍不足的分化後期，Zfpm1等在譜系定型的階段（節點45至49，2966個基因）中正常表達的基因未顯示出統一的表達模式。Mof 本身出現在節點42中，該節點在Mof +/- 細胞中譜系確定的階段顯示出單個明顯的峰。節點42也含有紅細胞生成的主調節劑，如Klf1，GATA1，Gfi1b和EPOR，與MOF相似，MOF +/- 小鼠晚期相對於野生型，顯示顯著異常上調。此外，通過GO分析（圖S9C，請參閱補充數據），該cluster顯示出對已知紅系TF的富集。在Mof+/- 軌跡中發現的這些顯著差異也通過Monocle在基於軌跡的差異基因表達分析中得到了評分，相比野生型Mof+/- 細胞，明顯下調的基因有1063個（P <0.05；請參閱補充數據）。些分析表明，在Mof+/- 小鼠中少數HSCs紅系命運的確完全發生了異常。
圖6 DEFGHJ圖 KLM這些發現促使作者測試是否可以通過恢復H4K16ac沉積來拯救紅系譜系規範。為此，作者使用了Mof-iKO HSC，將其轉染了編碼野生型Mof（Mof）或催化失活突變體（Mof E350Q）的表達載體（圖6D）。通過異位表達Mof，作者不僅恢復了Runx1和Gfi1b 的水平，而且還恢復了紅系集落的形成。相比之下，Mof催化突變體無法恢復這些特徵（圖6，E和F和圖S9D）。接下來，作者想知道是否可以通過表達主要的類紅細胞TF或提高乙醯化水平來改善這些促紅細胞生成的幹擾。為此，作者用Gata1 的表達載體轉染了Mof-iKO HSPC，並通過FACS對HSC進行了分類（圖S9E）。平行地，用組蛋白脫乙醯酶抑制劑例-527處理MOF-iKO 或MOF+/- 造血幹細胞（處理過的42(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7314555/#R42 )，43(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7314555/#R43 )），以提高總體H4K16ac水平。集落形成試驗表明，在兩種情況下，紅系軌跡均被完全恢復（圖6，G到M和圖S9，從F到H）。值得注意的是，異位表達的Mof在野生型細胞中也顯示出擾動的集落形成，認為Mof劑量在HSC分化過程中起著至關重要的作用。總之，作者的結果表明，Mof 的適當劑量和定時表達可調節TF相互調節的網絡，如Runx1，Gfi1b和Gata1，它們的表達受MOF介導的組蛋白乙醯化作用調節（圖S9I）。這些結果確立了譜系特異性H4K16ac驅動的染色質可及性在體內紅系命運中的關鍵作用。
總結看我的樣本數據介紹，就知道作者分析的數據很多了吧。現在的難點：就是多組學整合分析，作者在多組學數據整合分析中各組學分析相互驗證，並且有很多實驗驗證，是一篇工作滿滿的文獻，剛入門真正理解還是挺難的，和大家一起學習，至於詳細的實驗方法和附加圖材料，感興趣的讀者看原文哈！（DOI:10.1126/sciadv.aaz4815）關於此文獻對我目前工作所提供的靈感就不和大家分享了，有問題的留言哈！頭腦風暴：想想閱讀此文獻你得到了什麼好點子？