Northern 雜交需要大量的材料,受RNA降解影響很大

2020-12-11 紅毛丹小妹

如今有多種程序被用來測定總RNA或poly(A)*RNA樣品中特定mRNA的豐度。最常用的方法包括Northerm雜交、核糖核酸酶保護,以及定量反轉錄PCR ( RT-PCR)。這些方法各有優缺點。

●Northern 雜交需要大量的材料,受RNA降解影響很大。敏感性低,而且在測量同一樣品中不同mRNA的豐度時是一種笨拙的方法。

不過它的獨特優勢在於可同時提供相對分子質量和豐度兩個方面信息。通過與持家基因轉錄物或者與外加的標準核酸探針再次雜交進行定量,對於比較不同組織中剪接變體的轉錄物的表達特別有用(見「用Northern雜交進行RNA轉移」)。

●核糖核酸酶保護不需要完整的RNA,它比Northern雜交敏感20~100倍,可檢測到特異10個拷貝轉錄物。這種方法可容易地同時處理多種靶mRNA,而且由於所產生的信號強度直接與靶mRNA濃度成正比,所以比較靶RNA在不同組織中的表達水平極易做到。

但是,核糖核酸酶保護最好利用與靶mRNA恰好互補的反義核酸探針,如果實驗產生的RNA-RNA雜交體含有易於被核糖核酸酶切割的錯配鹼基時,這會是個問題( 如在分析相關的mRNA家族時)。

最好通過使用一種(Pape et al.1991)或兩種(Davis et al.1997)合成的、通過分子質量大小區別於內源靶RNA的有義鏈模板建立標準曲線來定量靶RNA。

●實時定量RT-PCR (見第9章,方案4)具有許多其他方法無法比擬的優勢。

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