做了快7年的分子克隆，從加樣加不好，到現在輕鬆PCR，我想分子生物學這塊還是有很多經驗可以分享一下的。
或許很多人會說分子克隆過程中出現問題最多的大概就是連接了，大家抱怨的也最多，我也陷入在個步驟上很久。經過長時間的摸索我在連接這個問題上有一些體會，我認為連接的問題多集中在連接的體系、DNA的用量、vector和insert的比例、連接酶等。但是我認為，連接不成功，問題並不一定出在連接這步上。有很多環節影響連接的成敗，如酶切的好不好、回收的質量好壞、連接時的濃度或比例、感受態等。以下我詳細說明。
1，PCR引物的設計。
通俗地說，很多人用了很多軟體設計來設計去，又是考慮髮夾結構，又是考慮二聚體，又是考慮Tm值，折騰來折騰去，但其實沒那麼複雜。首先保證你要的基因是正確的，這個可以從NCBI中找到，大部分是沒問題的，然後再找到起始密碼子，從那開始大概上遊取20-27bp，加上酶切位點，加上保護鹼基（一般3個）就是上遊引物，取後20-27bp鹼基，反向互補，加上酶切位點和保護鹼基組成下遊引物。這樣引物設計就完成了，可以放到軟體裡看看GC含量，Tm值，髮夾結構，二聚體等，適當調整鹼基個數和保護鹼基的個數。需要額外注意的是移碼問題。
需要指出的是設計引物時一定要考慮切點的甲基化問題。做普通的克隆會涉及到甲基化形式有兩種：dam甲基化和dcm甲基化。常用的大腸桿菌都有這兩種甲基化酶。dam甲基化酶識別GATC位點並甲基化；dcm甲基化酶識別CCWGG位點（W是A或T）並甲基化。如果有這兩種位點那麼多數情況內切酶是切不開了。容易受甲基化影響的內切酶有：Dpn1（GA/TC）天生就甲基化；Cla1（ATC/GAT）如果前面加個G或後面加個C那麼恭喜你，dam甲基化；Xba1（T/CTAGA）如果前面加個GA或後面加個TC也是dam甲基化，等等有好多。這些容易甲基化的切點設計引物時一定要注意，避免引入甲基化位點。如果真是避免不了或者後來才發現問題，那麼把甲基化的質粒轉化到甲基化酶缺陷型大腸桿菌中再提質粒就沒有甲基化，可以切了。甲基化缺陷型菌有：DM1（Invitrogen）、INV110（invitrogen）、JM110等。
2，PCR產物。
兩種方式：一種純化後直接酶切連接；一種連T載體再往下切連接。我個人強烈建議第二種，連T載體。因為PCR產物直接酶切我覺得有兩個缺點：①由於兩頭把手太短，雖說有保護鹼基，但我覺得還是不如從質粒上往下切好切，而且容易切壞、切碎；②無法從電泳上看出來切沒切開，因為也就切下了幾個十幾個bp，帶形沒啥變化。連T載體的優點：①進載體後，大提一次的質粒誇張點說夠用一輩子的，不用總PCR往出調了，再說PCR那東西還不太穩定，一把多一把少的。②酶切會很清晰，切下來了就是有帶，沒切動就是沒有，沒連上也能知道不是沒切開而是別的步驟有問題。連T載體也有些麻煩的地方，如需要的切點有時跟T載體上自帶的切點衝突，這就要小心鑑別；而且連T載體最好測序看一下PCR的產物對不對、切點對不對。總體來講連T載體是很有優勢的。
3，提質粒
有時手工小提或粗提的質粒酶切效果不好，這可能是提取的不夠純或者內切酶品質不好。所以若酶切效果不佳建議用柱子精提或大提。
4，酶切
用於連接的酶切很關鍵。需注意如下幾點：
①如果是雙酶切A和B，預實驗中必須做A和B各自的單酶切和A+B的雙酶切,好確認這幾種酶都好用，質粒上的切點都好用。如果切不開就要考慮是不是酶的問題，buffer的問題，質粒上有沒有這些切點，序列是否甲基化等。
②酶切儘量用大體系，如50ul、100ul等。大體系能稀釋內切酶包裝中的甘油，對反應有利。相反，連接儘量用小體系，以增加DNA末端的碰撞機會。
③如果要回收、連接，酶切用的DNA量我的經驗是不用太大。大了會切碎，形成一些不規則的末端，不利於連接。
④酶切後的電泳，即切膠的那次電泳中，如果切成的條帶很清晰，不拖泥帶水，沒有彌散，沒有拖尾，那做回收、連接效果最好。相反，若有彌散、拖尾、不清楚、一團亮等情況就是切的不好，做後續實驗成功率會降低。若真是效果很差建議改進體系重新切。
5，回收
回收可以用柱式試劑盒或手工法。柱式回收試劑盒：此類試劑盒適合各種長度DNA，對黏性末端基本沒有破壞，回收效率也不錯。手工醇沉法步驟如下，把切得的膠弄碎，用Tris-HCl浸泡一段時間，吸出所有的液體，用酚抽提一遍，氯仿抽提一遍，加鹽和醇醇沉，沉澱用70％乙醇漂洗，再用Tris溶解。次方法優點是對DNA和黏性末端的損傷最小，缺點是容易損失DNA。若本來DNA數量就不多，用手工法很容易丟失殆盡；如果DNA量很大可以考慮使用。
回收後要電泳，一來估算回收液濃度，二來看回收DNA的質量。若條帶有彌散，即自目的條帶以下有拖痕，不是清晰利落的一條帶，則質量不好。因為條帶拖痕表示它已碎裂成比它小的各種長度的片段，而主帶雖然還在那個位置但也已遭到一定程度的破壞。質量不好的回收產物做連接成功率會降低，假陽性克隆會增加。造成回收質量差的原因可能是回收這步，也可能是酶切那步，如果酶切那步出現酶切④所描述的情況，就容易造成回收質量不好。只有回收到清晰、利索的條帶，才不影響連接。
6，感受態
做連接要求感受態的效率要高。感受態的感受效率一般剛製備完時是最高的，以後逐漸減弱，而且每次開－80℃冰箱溫度微升對感受態效率都有一定影響，久而久之效率就不行了，這就要求大家取感受態時動作迅速、最大程度減少感受態盒升溫。都知道感受態效率高好，但麻煩的是感受態效率的高低不好通過實驗來檢測，因為若通過轉質粒來檢測，只要是效率中等的感受態都能長出很多克隆。所以如果你們的感受態已經儲存了很長時間或者連接長的克隆連續幾把都太少就要重做感受態了。製備感受態不推薦新手直接去做，最好由經驗豐富者做或他帶你做。用新做的感受態轉質粒，用同樣手法用量，你會發現比舊感受態明顯多長很多克隆。
7，連接
最後才輪到連接。連接的問題討論的是比較多的。如果前述若干步驟所得產物質量好，連接不會很難。
①DNA的量：DNA總量有幾十ng就能連接成。當然如果你的DNA質量好，DNA用量越大連接效率越高。就怕你為了追求DNA數量而降低了質量，那可就得不償失了。
②vector和insert的比例：如果insert不長（2kb以下）、vector是insert的幾倍長，可以用1：3－1：9。如果insert較長（3、4kb以上）、vector和insert長度相似或insert比vector還長，可以用1：1－1：3。短片段的連接相對容易，做的好可以挑到好多正確的克隆。長片段的連接效率較低，陽性克隆率小於等於10％是很正常的。我做過一個長片斷的連接，6k的vector、6k的insert，比例用1：1，挑了20個克隆有一個對。
③體系體積：通常用20ul都能連上，若連長片段可以壓縮成10ul（前提是DNA數量不變）。我覺得體系不是很關鍵，有位很精通克隆的老師說他都用50ul體系，照樣百發百中。而且如果你的DNA是用EB（即Tris）溶解的，體系中不加水也行。前述我自己連的長片段也是用20ul體系，vector和insert各上8ul。
④T4連接酶：酶這東西自然是越貴越好，一分錢一分貨，而且連接酶控制著整個分子克隆過程的瓶頸——連接，強烈建議買好的。我用過Promega的，還好；BBI的湊合用。如果連長片段就加二倍的連接酶。
⑤連接時間：過夜。過夜就應該足夠了，但是你要是不急著轉化放到4度放幾天也行，我個人認為時間長只好不壞。
⑥連接溫度：最適是16℃。有人用PCR儀造16℃，我用泡沫冰盒加涼水再添冰，用手感覺差不多十四五六度，然後蓋蓋過夜，基本上溫度不太變。你若感覺好不溫度，拿個溫度計測也行。有人用4度連接，也行，我有時先16度過夜，再放4度裡幾天。
⑦轉化：連接的轉化不能像轉質粒那麼隨便，要小心翼翼，儘量作到不放棄任何一個菌。一般所用的感受態體積最少是連接體系的5倍。長片段的連接轉化時搖菌2小時。
⑧對照：對照很關鍵，可以反應出很多重要的信息，不要懶，你的連接若是問題不少，就要乖乖的做對照。一般有如下幾種對照方式：
⑴轉化質粒對照。和連接產物同樣抗性、一起轉化、塗在同一個板上。這個對照目的是檢測轉化系統是否有效，即抗生素是否有效、板子是否有效、轉化的手法是否正確、以及感受態的效率如何（這需要你每次轉化質粒都用相同的手法、用量，看長的菌落數，若明顯太少就要懷疑感受態）。還有一個作用，如果質粒早就長出來了，都長挺大了你的連接產物還沒動靜呢，那八成是沒戲了，別等了趕快去準備下次連接的材料吧。
⑵切完回收的vector直接轉化對照。如果你是雙酶切，切完的vector和沒切的vector的長度相差不大，或跑電泳這兩種跑不很開，就要做這個對照。目的是看切的是否徹底，是否還有環狀質粒存在。長不出克隆是對的，若長出克隆，好好改進你的酶切系統吧。
⑶切完回收的vector加連接酶自身連接再轉化做對照。雙酶切的，最好要做這個對照，而且這個對照長的克隆要挑若干提質粒。一、若切完的目的vector和沒切的vector的長度相差較大，電泳條帶離的遠，這個對照能檢測酶切和回收的質量。如果DNA末端遭破壞或斷裂，會隨機產生各種末端，這些末端少數能連接到一起，長度上小於等於回收的vector。二、若切完的vector和沒切的vector的長度相差不大，這個對照除了檢測「一」中所說的還檢測是否有隻進行了單酶切的。總之不長克隆或只長很少是對的，長多了還是去改進上遊的步驟吧。
如果上面的各步都注意到了而且做的很好，那成功率會較高，但也不能保證一次成功。在確保各步驟產物質量都不錯的前提下若重複3、5次還沒連上就要回頭仔細檢查這個克隆的策略有沒有問題了，要是策略就有毛病你還懵然不覺那可就怎麼做也做不出來了。
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