【實驗專欄】蛋白檢測篇之GST pull-down

2021-02-08 山東聖劍醫學研究有限公司

開設實驗專欄意在為科研人員提供熱門的生物醫藥實驗方法參考,為科研愛好者實驗提供一些相關性參考,以及實驗經驗，以幫助他們更加高效的完成實驗。


專欄主要分為基因操作工具、細胞實驗部分、動物模型部分、組織水平部分、分子機制部分和實驗方案範例六大專題。接下來將為大家分享分子機制部分的蛋白檢測篇之GST pull-down。 




GST pull-down實驗是一個行之有效的驗證酵母雙雜交系統的體外試驗技術，近年來越來越受到廣大學者的青睞。

其基本原理是將靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase穀胱苷肽巰基轉移酶）融合蛋白親和固化在穀胱甘肽親和樹脂上,作為與目的蛋白親和的支撐物，充當一種「誘餌蛋白」，目的蛋白溶液過柱，可從中捕獲與之相互作用的「捕獲蛋白」(目的蛋白)，洗脫結合物後通過SDS-PAGE電泳分析，從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應的目的蛋白，「誘餌蛋白」和「捕獲蛋白」均可通過細胞裂解物、純化蛋白、表達系統以及體外轉錄翻譯系統等方法獲得。





體外檢測蛋白質與蛋白質之間相互作用，用於驗證兩個已知蛋白的相互作用，或者篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。



利用重組技術將探針蛋白與GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通過GST與固相化在載體上的GTH（Glutathione）親和結合。因此，當與融合蛋白有相互作用的蛋白通過層析柱時或與此固相複合物混合時就可被吸附而分離。




１. Glutathione瓊脂糖珠預處理；


２. GST融合蛋白掛柱：取適GST-融合蛋白與已經處理過的beads置於管中，4℃，搖床孵育過夜；


３. 孵育過夜的蛋白質與beads的混合液於4℃，離心,上清收集，觀察融合蛋白是否飽和地掛在beads上；


４. 把轉染目的基因的細胞裂解在細胞裂解液裡（含蛋白酶抑制劑），最大轉速4℃離心，收集上清液；


５. 將細胞裂解液上清加入beads；


６. 加上SDS上樣緩衝液；


７. SDS-PAGE，Western Blot或者質譜儀分析。





今天的分享就到這裡結束了，喜歡的朋友記得收藏一下呦！

 

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