關於限制性核酸內切酶（下面簡稱限制酶）的定義是：能夠識別和切割 DNA 分子內一小段特殊核苷酸序列的酶。因為限制酶能切割 DNA 分子，所以將其稱為「基因的剪刀」、「分子手術刀」等。不同限制酶識別的鹼基序列一般不同，但切割後所產生的黏性末端可能是一樣的，像這種能切割不同的 DNA 片段但產生相同黏性末端的一類限制酶稱為同尾酶。如 BglⅡ和 BclⅠ，它們的識別位點分別為 AGATCT 和 TGATCA, 但能切出相同的黏性末端，如圖 1 所示。不一定。能識別相同序列的限制酶稱為同裂酶，但其切割位點可能相同也可能不同。具體可分為以下幾種情況：1）同序同切酶。 這些酶的 DNA 識別序列和切割位置都相同，如 MboⅠ與 Sau 3AⅠ識別切割位2）同序異切酶。 這些酶的識別序列相同但切割位點不同， 如 KpnⅠ和 Acc 65Ⅰ識別的序列是都GGTACC，但它們的切割位點不同，如圖 3 所示。3）同功多位酶 。 一些能識別簡併序列的限制酶包含了另一種限制酶的功能。 如 EcoRⅠ識別和切割位點為 G\ AATTC，ApoⅠ識別和切割位點為NN\ AATTNNN，後者可識別並切割前者的序列。DNA 中的一段倒置重複序列 ，當該序列的雙鏈被打開後，可形成髮夾結構，這段序列被稱為迴文序列。 其特點是在該段的鹼基序列的互補鏈之間正讀反讀都相同（並非在同一條鏈上正讀反讀）。例如正讀：5′GGTACC3′，反讀：3′CCATGG5′。1） 迴文序列 ： 限制酶識別的序列大多數為迴文序列， 切割位點在DNA2條鏈相對稱的位置。回文對稱結構的序列經限制酶切割後， 產生的末端為匹配黏性末端， 這樣形成的 2 個末端是相同的，也是互補的，如圖 4 所示。在回文對稱軸上同時切割 DNA 的 2 條鏈，可能產生平末端，產生平末端的 DNA 可任意連接，但連接效率較黏性末端低，如圖 5 所示。2） 非對稱序列有一些限制酶的識別序列是不對稱的。 當識別序列為非對稱序列時，切割 DNA產生的黏性末端是不同的，稱為非對稱突出端。如BbvCⅠ，它的識別切割位點見圖 6。限制酶對 DNA 的切割位點大多數在識別序列內部，但也有在識別序列外部的，如圖 7 所示多數的限制酶只能識別 1 種特定的核苷酸序列，但也有例外,如前面所講的同功多位酶，能夠識別多種核苷酸序列，如圖 8 所示。在浙科版「現代生物科技專題」第 5 頁中提到獲取目的基因通常有 2 種方法，序列已知可以用化學方法合成或者用 PCR 擴增目的基因，序列未知可以從基因文庫中獲取目的基因。但在實際題目中往往是讓學生選擇用哪種限制酶去獲取目的基因，容易使學生形成「目的基因的獲得一定用到限制酶」這樣的錯誤認知。在構建某種生物的基因文庫時常用到限制酶，通常是將某種生物材料的遺傳物質 DNA 用限制酶切成片段，插入到載體分子中，並將重組載體轉入宿主細胞，然後再用某種探針選擇、釣取目的基因。 但是用化學合成法或PCR擴增目的基因過程中不一定用到限制酶，可見，目的基因的獲得不一定需要限制酶。在浙科版「現代生物科技專題」第 6 頁中提到獲得目的基因後，要將其與載體 DNA 連接在一起，通常是用相同的限制酶分別切割目的基因和載體 DNA，然後用 DNA 連接酶將目的基因和載體 DNA 連接在一起，形成重組 DNA 分子。從「通常」2 個字可知構建重組 DNA 時不一定用到限制酶，例如，利用 PCR 技術獲取目的基因時，通常是用耐熱性 DNA 聚合酶（如 Taq DNA 聚合酶等）擴增目的基因序列。 Taq DNA 聚合酶等擴增得到PCR 產物的 3′端附有 1 個「A」鹼基，可以在 DNA連接酶的作用下連接到 PCR 產物克隆專用載體（也稱為通用載體），如 pMD18 -T 載體。在pMD18-T 載體等通用載體插入位點2側的 3′端添加了一個「T」鹼基，這樣恰好可以與 PCR 產物末端的「A」鹼基配對，得到含有目的基因序列的重組 DNA 分子。這種重組 DNA 分子可以很方便地轉化到感受態細胞中，進行 DNA 測序以及後續的相關實驗，如圖 9 所示。構建重組 DNA 時，通常是用相同的限制酶分別切割目的基因和載體DNA，這樣會在目的基因和載體的兩端形成相同的黏性末端，然後用 DNA連接酶將目的基因和載體連接在一起，形成重組DNA分子。但是這種情況下的兩兩連接產物除了重組 DNA 分子，還有目的基因-目的基因連接產物、載體-載體連接產物。為了防止目的基因和載體在酶切後產生的末端發生任意連接，酶切時常會選擇不同的限制酶。基因工程中常用兩種限制酶酶切質粒和目的基因，可以為防止錯誤連接及自身環化、和反向連結。但實際操作中要考慮到目的基因兩端可能沒有兩種限制酶的酶切位點；若是人工合成需要人為的加上粘性末端。2016·全國卷Ⅰ節選：某一質粒載體如圖所示，外源DNA插入Ampr或Tetr中會導致相應的基因失活(Ampr表示氨苄青黴素抗性基因，Tetr表示四環素抗性基因)。有人將此質粒載體用BamHⅠ酶切後，與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉化大腸桿菌，結果大腸桿菌有的未被轉化，有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種，分別是含有環狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌。回答下列問題：(2) 如果用含有氨苄青黴素的培養基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉化的和僅含環狀目的基因的細胞是不能區分的，其原因是 ① ；並且 ② 和 ③ 的細胞也是不能區分的。其原因是 ④ 。在上述篩選的基礎上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有 ⑤ 的固體培養基。答案：① 二者均不含有氨苄青黴素抗性基因，在該培養基上均不生長; ②含有質粒載體（空載）;③含有重組質粒;④二者均含有氨苄青黴素抗性基因，在該培養基上均能生長;⑤四環素解析：目的基因和載體有同一種酶酶切後，會形成相同的粘性末端，再用DNA連結酶催化時，會有下圖的三種情況。且上述題目中，目的基因插入破壞了四環素的抗性基因，因此導入了重組質粒的受體菌，可以在含有青黴素的培養基生長，但不能在含有四環素的培養上生長。科學家將外源目的基因與大腸桿菌的質粒進行重組，並在大腸桿菌中成功表達。如圖表示構建重組質粒和篩選含目的基因的大腸桿菌的過程。 請據圖回答問題。（1）圖中質粒上有抗氨苄青黴素和抗四環素兩個標記基因，經過①和②步驟後，有些質粒上的 基因內插入了外源目的基因，形成重組質粒，由於目的基因的分隔使得該抗性基因失活。（2）步驟③是 的過程，為了促進該過程，應該用 處理大腸桿菌。（3）步驟④將三角瓶內的大腸桿菌接種到含四環素的培養基Ｃ上培養，目的是篩選 ，能在Ｃ中生長的大腸桿菌有 種（4）步驟⑤：用無取Ｃ上的單個菌落，分別接種到Ｅ（含四環素），然後用影印法接種到D（含氨苄青黴素和四環素）上，一段時間後，菌落的生長狀況如圖所示。含目的基因的 菌落位於 （填Ｄ或Ｅ）上，請在圖中相應的位置上圈出來。
答案（1）氨苄青黴素抗性；（2）將重組質粒（目的基因）導入大腸桿菌（受體細胞）CaCl2溶液；（3）含四環素抗性基因的大腸桿菌 ２ ；（4）E2018浙江溫州3月選考模擬 利用圖示質粒和目的基因培育轉基因醋化醋桿菌。圖中標註了相關限制性核酸內切酶的識別序列和酶切位點,其中酶切位點相同的酶不重複標註。請回答下列有關轉基因的問題:(1)利用圖示質粒和目的基因構建重組質粒,應選用 兩種限制酶切割。解析：為防止錯誤連接（包括反向連結）和自身環化應採用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制性核酸內切酶切割。2020年1月浙江高考29：為了提高目的基因和質粒重組的成功率，選擇使用____________，對含目的基因的DNA片段進行處理，使其兩端形成不同的粘性末端，對質粒也進行相同的處理，然後用DNA連接酶連接形成重組質粒。通過在大腸桿菌中________，以獲得大量的重組質粒，最終將其導入原生質體中。
第一空考查了限制酶切割的兩種方式，即黏性末端和平末端是怎麼產生的。裸奔式：目的基因的獲取需要 酶切割。情景式：從圖中選擇目的基因插入的位置，需要具體什麼酶。
限制酶作為酶類，決定其催化作用具有高效性、專一性和作用條件溫和等特點。其中專一性的具體表現為：某種限制酶只能催化DNA上特定序列特定位點的磷酸二脂鍵水解，結果是使DNA分子被分割成不同的DNA片段。限制酶所識別的雙鏈DNA上的序列具有「回文對稱」性質，即無論是奇數個鹼基還是偶數個鹼基，都可以找到一條
中心軸線，中心軸線兩側的雙鏈DNA上的鹼基是反向對稱重複排列的。當限制酶在它識別序列的中心軸線兩側將DNA的兩條鏈分別切開時，即錯位平切，產生的是黏性末端；當限制酶在它識別序列的中心軸線處切開時，即平切，產生平末端。錯位切的限制酶在基因工程中最常使用，因為與平末端相比較，黏性末端更有利於DNA片段的連接。例1下面是5種限制性內切酶對DNA分子的識別序列和剪切位點圖（↓表示剪切點、切出的斷面為黏性末端）：限制酶1：——↓GATC——； 限制酶2：——CATG↓——；限制酶3：——G↓GATCC——； 限制酶4：——CCGC↓GG——；構建重組質粒，需要用限制酶分別切割含目的基因的DNA片段和質粒，切割方法主要有
單酶切和雙酶切。單酶切是指用同一種限制酶對含目的基因的DNA和質粒進行切割，目的基因序列的兩邊必須各有一個能被該限制酶識別的序列及切點，而質粒至少有一個識別序列及切點，這樣被切割的質粒與切下的目的基因兩邊形成相同的黏性末端，以實現連接而形成重組質粒，有時也可以用兩種不同的限制酶（同尾酶）切割產生相同的黏性末端。雙酶切是指用兩種限制酶進行切割，含目的基因的DNA和質粒上都必須有能被這兩種限制酶識別的序列及切點，結果兩者都會產生具有兩種不同的黏性末端的DNA片段，兩個末端分別用A與B表示，然後混合起來，那麼載體分子的A端與目的基因的A端連接，載體分子的B端與目的基因的B端連接，形成重組DNA分子，這樣就可以
避免DNA連接酶催化時被切割後的質粒自連成環的現象，並能保證質粒與目的基因的定向連接。例2基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和質粒，便於重組和篩選。已知限制酶I的識別序列和切點是—G↓GATCC－，限制酶Ⅱ的識別序列和切點是－↓GATC－。根據圖示,判斷下列操作正確的是( )酶切圖譜是指選取某一特定長度的DNA分子，用多種限制酶單獨或聯合切割，再通過電泳技術將酶切片段進行分離，計算相對大小，以確定每一種限制酶在DNA分子中的切點位置和相對距離，並據此繪製而成的物理圖譜（一般以直線或環狀圖式表示）。例3.用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ單獨或聯合切割同一種質粒，得到的DNA片段長度如下圖(1kb即1000個鹼基對)，請在下圖中畫出質粒上EcoRⅤ、MboⅠ的切割位點。
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