今天給實驗新人講講測蛋白的方法吧，實驗達人請忽略。用考馬斯亮藍法測蛋白質濃度，一般我們為了測得準，就做三個復孔，看下圖就是我做的空白對照，接下來就是樣品組。
首先，配製一組濃度分別為0.10mg/ml ，0.08mg/ml，0.06mg/ml ，0.04mg/ml ，0.02mg/ml，0 mg/ml的牛血清蛋白(BSA)溶液，測定這組溶液的吸光度，得到蛋白質濃度對吸光度的一條標準曲線。這是為接下來測定未知蛋白質濃度樣品的吸光度，就是根據標準曲線得到蛋白質的濃度的。
原理：考馬斯亮藍(CBB)測定蛋白質含量屬於染料結合法的一種。考馬斯亮藍在游離狀態下呈棕紅色，最大光吸收在488nm; 當它與蛋白質結合後變為藍色，蛋白質—色素結合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比，因此可用於蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍結合在2min左右的時間內達到平衡，完成反應十分迅速;其結合物在室溫下1h內保持穩定。該法試劑配製簡單，操作簡便快捷，反應非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質含量。
實驗過程：先配製1 mg/ml的牛血清蛋白(BSA)母液，再往母液中加入磷酸緩衝溶液(PBS )配製一組濃度分別為1.0mg/ml ，0.8mg/ml，0.6mg/ml ，0.4mg/ml ，0.2mg/ml的BSA溶液，再將這組溶液稀釋10倍，得到一組濃度分別為0.10mg/ml ，0.08mg/ml，0.06mg/ml ，0.04mg/ml ，0.02mg/ml的BSA溶液。計算第一步稀釋各組需要的BSA溶液及PBS溶液的體積。
3.具體操作過程。
用天平稱量1.00g牛血清蛋白(BSA )，溶於去離子水中，配成100ml的溶液，溶液的濃度為10mg/ml。用移液槍分別取100ul，80ul，60ul，40ul，20ul的BSA溶液，置於1.5ml的EP管中，再分別加入900ul，920ul，940ul，960ul，980ul的磷酸緩衝溶液(PBS)配成1ml的溶液，震蕩使溶液混合均勻。得到一組濃度分別為1.0mg/ml ，0.8mg/ml，0.6mg/ml ，0.4mg/ml ，0.2mg/ml的BSA溶液。
移液槍分別移取100ul剛配好的一組BSA溶液，置於1.5ml的EP管中，各加入900ul的PBS溶液，震蕩使溶液混合均勻。得到一組濃度分別為0.10 mg/ml ，0.08mg/ml，0.06mg/ml ，0.04mg/ml ，0.02mg/ml的BSA溶液。另外量取1ml的PBS溶液(BSA溶液濃度為0 mg/ml)作對照試驗。
用移液槍分別移取50ul配好的一組BSA溶液，滴加到孔板中，再分別加入200ul的考馬斯亮藍(CBB)。靜置10min後，用酶標儀測得這組BSA溶液的吸光度。
四、實驗數據及處理
測得的BSA溶液的吸光度如下：
用orgin作出吸光度對BSA濃度的關係曲線。
五、實驗結果分析
得到的吸光度對BSA濃度的關係曲線為y=3.09x+0.6807，R2=0.9541。可以看出吸光度—濃度的關係曲線中R2值較小，即測得的吸光度與濃度的線性不是很好。究其原因可能有以下兩點：一是移液槍的操作不是很熟練，二是移液槍在移液過程中存在著氣泡，使移的液體體積不準確。
有了標準曲線，就開始測我們的蛋白樣品，先加PBS 8微/孔，再加蛋白樣品2微/孔，最後加考馬斯亮藍190微/孔。然後微量震蕩儀震蕩（跟上面做標曲的時間等條件要一致），顯色後，放酶標儀，選中測量的區域，在595波長出測出吸光度，最後用以上的標曲公式計算出未知蛋白的濃度（我們實驗室用graph pad）。
注意：我前面蛋白是加了2微/孔，所以濃度還要除以2，才是真正的濃度。