進入70年代早期,許多重要的發展促進了核酸雜交技術的進展

2021-01-07 娛在其中

進入70年代早期,許多重要的發展促進了核酸雜交技術的進展。例如,對特異基因轉錄產物的分析和對動力學雜交實驗又有興趣。固相化的Poly U –Sepharose和寡(dT)-纖維素使人們能從總RNA中分離PolyA+ RNA。用mRNA的經純化技術可從網織紅細胞總RNA中製備α-和β-珠蛋白mRNA混合物。這些珠蛋白mRNA首次被用於合成特異的探針以分析珠蛋白基因的表達。由於製備cDNA探針很繁瑣,所獲得cDNA的長度和純度也不穩定。所以尋求新的探針來源是使分子雜交技術進一步推廣的基礎。

70年代末期到80年代早期,分子生物學技術有了突破性進展,限制性內切酶的發展和應用使分子克隆成為可能。各種載體系統的誕生,尤其是質粒和噬菌體DAN載體的構建,使特異性DNA探針的來源變得十分豐富。人們可以從基因組DNA文庫和cDNA文庫中獲得特定基因克隆,只需培養細菌,便可提取大量的探針DNA。迄今為止,已克隆和定性了許多特異DNA探針。

由於固相化學技術和核酸自動合成儀的誕生,現在可常規製備18~100個鹼基的寡核苷酸探針。應用限制酶和Southern印跡技術,用數微克DNA就可分析特異基因。特異DNA或RNA序列的量和大小均可用Southern印跡和Northern印跡來測定,與以前的技術相比,大大提高了雜交水平和可信度。

儘管取得了上述重大進展,但分子雜交技術在臨床實用中仍存在不少問題,必須提高檢測單拷貝基因的敏感性,用非放射性物質代替放射性同位素標記探針以及簡化實驗操作和縮短雜交時間,這樣,就需要在以下三方面著手研究:第一,完善非放射性標記探針;第二,靶序列和探針的擴增以及信號的放大;第三,發展簡單的雜交方式,只有這樣,才能使DNA探針實驗做到簡便、快速、低廉和安全。

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