2018年9月30日/生物谷BIOON/---基因組編輯技術CRISPR/Cas9被《科學》雜誌列為2013年年度十大科技進展之一，受到人們的高度重視。CRISPR是規律間隔性成簇短回文重複序列的簡稱，Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱。CRISPR/Cas最初是在細菌體內發現的，是細菌用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防禦系統。
即將過去的9月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或發現呢？小編梳理了一下這個月生物谷報導的CRISPR/Cas研究方面的新聞，供大家閱讀。
1.Nat Biotechnol：將細菌基因組致病島改造成一種抗葡萄球菌神器金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）通常對抗生素產生耐藥性，因而對安全的醫院護理構成威脅。在一項新的研究中，來自美國紐約大學醫學院的研究人員發現，從病毒進化而來的基因組「島嶼（islands）」能夠轉化為阻止金黃色葡萄球菌感染的抗菌「無人機（drones）」。相關研究結果於2018年9月24日在線發表在Nature Biotechnology期刊上，論文標題為「Conversion of staphylococcal pathogenicity islands to CRISPR-carrying antibacterial agents that cure infections in mice」。他們發現某種類型的細菌DNA經基因改造後能夠讓殺死或致殘細菌的基因替換致病性基因。
圖片來自Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt.4203。
這種研究中著重關注的這種類型的細菌DNA是一種「致病島（pathogenicity island, 也譯作毒力島）」，它是從病毒中進化而來的，並且永久地停留在病毒感染的細菌中，成為其遺傳系統的一部分。結果就是形成一種混合實體（hybrid entity），這種混合實體含有細菌在繁殖時傳遞給後代的有用基因，但在某些情況下也會切除細菌上層結構，並像病毒一樣被包裝在蛋白外殼（衣殼）中，這樣就將它的DNA注射到其他的細菌細胞中。
這些研究人員表示，這種進化飛躍的混合體將基因組島嶼塑造成完美的類似於無人機的載體，為細菌群體運送基因載荷（genetic payload）。當通過注射讓小鼠遭受致命性的葡萄球菌感染時，他們進行基因改造過的金黃色葡萄球菌致病島（SaPI）殺死了這些細菌並拯救了這些遭受感染的小鼠。
2.Nature子刊：利用經過CRISPR基因編輯的皮膚貼片阻止古柯鹼過量吸食有尼古丁貼片（nicotine patch）來幫助戒菸，隨後還有這個：皮膚貼片，經基因改造後產生一種消化古柯鹼的酶，並且當被移植到小鼠身上時，它們讓這些小鼠抵抗致死劑量的古柯鹼。在一項新的針對這種皮膚貼片策略的研究，來自美國芝加哥大學的研究人員希望這可能有朝一日能夠導致一種治療人類成癮和阻止古柯鹼過量吸食的方法。相關研究結果於2018年9月17日在線發表在Nature Biomedical Engineering期刊上，論文標題為「Genome-edited skin epidermal stem cells protect mice from cocaine-seeking behaviour and cocaine overdose」。論文通信作者為芝加哥大學幹細胞研究員Xiaoyang Wu和芝加哥大學成癮研究員Ming Xu。
Wu團隊之前曾使用CRISPR基因編輯技術，用表達胰島素的細胞為糖尿病小鼠製造出一種皮膚貼片，他想知道這種策略是否也適用於古柯鹼成癮。根據一項調查，90多萬美國人濫用這種藥物。因此，Wu與Xu合作開展實驗。
人類天然地會產生一種被稱作丁醯膽鹼酯酶（butyrylcholinesterase）的酶，這種酶能夠降解古柯鹼，但是這些研究人員想要讓他們的皮膚移植物能有更強大的功能。因此，他們使用了另一個研究團隊已設計出的這種酶的增強形式，它降解古柯鹼的活性是這種酶原始形式的4400倍。他們利用CRISPR將編碼這種酶加強形式的基因插入到小鼠的皮膚表皮幹細胞中，將這些細胞接種到1釐米寬的圓形支架上，然後將所形成的組織（即皮膚貼片）移植到對古柯鹼上癮的小鼠身上。
存在的一個問題是這種技術是否能夠像相對較小的胰島素那樣，讓相對較大的經過修飾的丁醯膽鹼酯酶進入血液。不過這個實驗取得了成功：在移植兩周後，一劑原本會致命的古柯鹼對小鼠沒有明顯的影響---顯然，這種酶在這種藥物（如果有的話）的大多數能夠達到小鼠的大腦之前就會將它降解掉。之前對古柯鹼上癮的小鼠在接受這種皮膚貼片移植後不再表現出對它們所在的封閉空間中的一個區域的偏好性，這是它們學會了將這個區域與古柯鹼攝入相關聯在一起。在移植10周後，這種皮膚貼片繼續產生這種酶直至實驗結束。
3.Science：重大進展！構建出增加基因組靶向範圍的CRISPR/Cas9系統在CRISPR/Cas9系統中，酶Cas9在DNA靶位點上進行切割，其中這種靶位點是這樣確定的：一種被稱作CRISPR RNA（crRNA）的RNA分子利用它的一部分序列與另一種被稱作tracrRNA的RNA分子通過鹼基配對結合在一起，形成嵌合RNA（tracrRNA/crRNA），然後，藉助crRNA的另一部分序列與靶DNA位點進行鹼基配對，以這種方式，這種嵌合RNA就能夠引導Cas9結合到這個靶位點上並進行切割。在實際應用時，人們可以將tracrRNA和crRNA作為兩種嚮導RNA（gRNA）或者融合在一起形成單向導RNA（single guide RNA, sgRNA），並被用來引導酶Cas9結合到靶DNA序列上並進行切割，其中Cas9與sgRNA一起被稱作Cas9-sgRNA系統。
圖片來自Frontiers in Genetics, 24 September 2015, doi:10.3389/fgene.2015.00300。
此外，CRISPR/Cas9系統靶向識別和切割與前間隔序列鄰近基序（protospacer adjacent motif, PAM）相鄰的特定DNA位點。作為一種最為頻繁用於基因組編輯的Cas9酶，來自釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9（SpCas9）僅識別作為PAM的NGG序列（簡稱NGG PAM，其中N代表任何一種鹼基），這就限制了基因組中能夠被靶向的區域。
在一項新的研究中，為了解決這個限制，來自日本東京大學、慶應義塾大學、大阪大學和美國布羅德研究所、麥戈文腦研究所和麻省理工學院的研究人員構建出一種合理設計的SpCas9變異體（SpCas9-NG），它能夠識別NG而不是NGG。這種SpCas9-NG變異體增加了基因組中的靶向範圍，但是具有與野生型SpCas9類似的特異性。晶體結構揭示出與第三個鹼基之間的鹼基特異性相互作用的喪失得到新引人的非鹼基特異性相互作用的補償，從而能夠識別作為PAM 的NG序列（NG PAM）。
這些研究人員進一步證實在人細胞中，這種SpCas9-NG變異體在攜帶著NG PAM的內源性靶位點中誘導鹼基插入或刪除（insertion or deletion, indel）。
最後，這些研究人員還發現將這種SpCas9-NG變異體與活化誘導的胞苷脫氨酶（activation-induced cytidine deaminase, AID）融合在一起能夠調節人細胞中攜帶著NG PAM的靶位點上的C→T轉化，即由鹼基胞嘧啶（C）轉化為鹼基胸腺嘧啶（T）。
4.Cell：首次解析出CRISPR-Cas13d的三維結構，有助揭示它的RNA靶向機制如今，在一項新的研究中，來自美國沙克生物研究所的研究人員首次解析出CRISPR-Cas13d的詳細分子結構。CRISPR-Cas13d是新興的RNA編輯技術中的一種有希望的酶。他們能夠利用低溫電鏡技術（cryo-EM）可視化觀察這種酶，其中cryo-EM是一種前沿的技術，讓人們能夠以前所未有的細節捕捉複雜分子的結構。相關研究結果發表在2018年9月20日的Cell期刊上，論文標題為「Structural Basis for the RNA-Guided Ribonuclease Activity of CRISPR-Cas13d」。論文通信作者為沙克生物研究所的Patrick D. Hsu和Dmitry Lyumkis。論文第一作者為沙克生物研究所的Cheng Zhang和Silvana Konermann。
在這項新的研究中，這些研究人員通過讓CRISPR-Cas13d在不同的動態狀態下凍存，並利用cryo-EM解析出這種酶的新的結構細節，從而能夠破解它的一系列活性，而不是僅在一個時間點觀察到一種活性。
5.Nature：重大突破！發現環狀核酸酶通過降解環狀寡腺苷酸讓III型CRISPR/Cas系統失活在一項新的研究中，來自蘇格蘭聖安德魯斯大學的研究人員鑑定出CRISPR基因組工程工具包中的一個重要的新組分。這將引發遺傳病和感染治療變革。相關研究結果於2018年9月19日在線發表在Nature期刊上，論文標題為「Ring nucleases deactivate type III CRISPR ribonucleases by degrading cyclic oligoadenylate」。論文通信作者為聖安德魯斯大學生物學院生物醫學科學研究中心的Malcolm White教授，論文第一作者為聖安德魯斯大學的Januka S. Athukoralage和Christophe Rouillon。
圖片來自Nature, doi:10.1038/s41586-018-0557-5。
人類利用幹擾素途徑來發出感染存在的信號並調動體內的防禦。最近，科學家們發現了CRISPR系統的一個意外方面：入侵病毒的遺傳物質觸發了環狀分子的合成。這些環狀分子是由4或6個腺苷一磷酸（AMP）分子連接在一起而形成的，而且與幹擾素一樣，是讓細胞進入抗病毒狀態的信號分子。它們通過激活一系列破壞入侵病毒並提供免疫力的降解酶來做到這一點。但是，如果長時間處於激活狀態的話，細胞也會死亡。為了避免這種命運，人們預測細胞具有分子「關閉開關（off switch）」，一旦感染被清除，這種「關閉開關」就會清除這些環狀分子。
當開始研究時，Athukoralage著手尋找這種難以捉摸的「關閉開關」。他成功地純化出一種酶，他命名為「環狀核酸酶（ring nuclease）」，它特異性地降解環狀分子。通過與來自聖安德魯斯大學生物學院生物醫學科學研究中心的同事們合作，他展示了這種環狀核酸酶如何結合併切割環狀分子，從而證實一旦病毒遭受破壞，這種「關閉開關」如何讓細胞恢復到未受感染的狀態。
6.Nat Microbiol：CRISPR篩選技術能夠找到抵抗黃病毒感染的關鍵基因最近，來自西南醫學中心的研究人員首次使用CRISPR全基因組篩選手段鑑定出一種有助於細胞抵抗黃病毒感染的基因。黃病毒是一類令人討厭的病原體，其中包括西尼羅河病毒，登革熱，寨卡病毒和黃熱病。在這項發表在《Nature Mircobiology》雜誌上的一項研究中，John Schoggins博士領導的研究小組利用CRISPR技術鑑定出IFI6基因是一種靶向黃病毒的強效抗病毒基因。之後，研究人員利用傳統的細胞試驗證實該基因在防止寨卡病毒，西尼羅河病毒，登革熱病毒和黃熱病病毒感染方面的作用。
Schoggins博士稱，他們最近開發的全基因組CRISPR篩選技術能夠幫助確定哪種幹擾素誘導的基因在抑制黃病毒感染方面發揮了重要作用。「我們對IFI6如何抑制黃病毒進行了相關的表型和機制研究，同時通過CRISPR篩選，使我們能夠找到IFI6這一抑制黃病毒感染的因子」，作者說到。
在細胞培養研究中，作者發現IFI6基因表達的蛋白質能夠有效抑制肝臟中黃熱病的感染，同時能夠抑制登革熱，寨卡病毒和西尼羅河病毒的感染。研究人員通過在腎臟和皮膚細胞系以及神經元中重複實驗證實了上述結果。
7.Nature：重磅！新研究使得在體內進行CRISPR/Cas9精準基因組編輯成為可能在臨床中使用CRISPR/Cas9基因編輯的一個障礙是Cas9核酸酶可能會在錯誤的位點上切割DNA。在一項新的研究中，來自美國麻省總醫院和英國阿斯利康公司的研究人員描述了一種在整個基因組中預測這些脫靶突變的策略，並且在小鼠中證實經過精心設計的嚮導RNA（gRNA）鏈不會產生任何可檢測到的切割錯誤。相關研究結果於2018年9月12日在線發表在Nature期刊上，論文標題為「In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations」。論文通信作者為阿斯利康公司生物學家Marcello Maresca和麻省總醫院生物學家與病理學家J. Keith Joung。
為了開發出一種讓脫靶效應最小化的方法， Maresca團隊與Joung團隊合作。他們開發出的這種方法的第一部分---最初由Joung團隊開發並於2017年發表（Nature Methods, doi:10.1038/nmeth.4278）---是在體外完成的。首先，他們將基因組DNA ---在這項新的研究中，他們用的是小鼠基因組---切割為大約長300個鹼基對的片段，隨後給這些片段連接上一系列讓DNA環化的接頭（adapter）。他們引入Cas9和gRNA的複合物，這種複合物在某些位點上切割環狀DNA，從而讓它線性化。
另一批核酸酶會降解剩餘的未被切割的環狀DNA。通過這種方式，這些研究人員能夠對線性化的DNA進行測序，以便觀察Cas9切割（不論是有意的還是無意的）的位點並預測gRNA是否會導致體內脫靶效應。
作為在這項新的研究中開發出的這種方法的第二部分，這些研究人員在小鼠中測試了他們的預測結果。當他們使用他們在體外發現的會在基因組中數千個錯誤位點進行切割的gRNA時，在他們檢查的一部分的預測位點中，超過40％的位點也在小鼠肝臟中發生突變。一個位點在體外篩選中出現的頻率越高，它在體內發生突變的可能性就越大。換句話說，在體外發生差錯的gRNA在體內也會發生差錯。
這些研究人員還在體內實驗中檢查了小鼠基因組中的通過計算預測可能為脫靶位點但是迄今為止並未在他們的體外篩選過程中出現的位點。他們並沒有在這些位點上檢測到突變，這意味著他們的體外方法可能不會錯過真正的脫靶位點。
8.PNAS：核小體或會抑制「基因魔剪」CRISPR-Cas9的切割效率近日，一項刊登在國際雜誌Proceedings of the National Academy of Sciences上的研究報告中，來自猶他大學的科學家們通過研究發現，核小體會抑制CRISPR/Cas9的切割效率，文章中，研究人員描述了如何在酵母樣本中檢測相關的基因編輯技術以及他們的研究發現。
「基因魔剪」CRISPR/Cas9能夠利用導向RNA來尋找並且切割DNA片段，但當靶向片段是核小體的一部分會發生什麼呢？此前研究人員通過研究發現，在這種情況下，似乎CRISPR/Cas9的切割效率會被降低；這項研究中，研究人員通過對這種情況進行體內試驗發現，此前的研究結果是正確的，即利用CRISPR/Cas9切割核小體或許會降低其作用效率。
文章中，研究人員利用CRISPR/Cas9技術對活酵母中不同的導向RNAs進行編輯，這就能夠實現對不同靶點的編輯。研究者表示，相比非核小體的區域而言，當對核小體區域進行編輯時，CRISPR/Cas9的編輯效率會發生降低；當研究人員對諸如鋅指等基因編輯技術進行監測時，他們並未發現任何差異，後期研究人員或將進行更為深入的研究來改善CRISPR/Cas9對核小體區域進行基因編輯的效率。
9.重磅！兩篇Science首次發現阻斷CRISPR/Cas12a的抗CRISPR蛋白在兩項新的研究中，兩個研究團隊利用生物信息學方法鑑定出阻斷Cas12a的抑制蛋白。儘管過去的研究已鑑定出幾種阻斷Cas9的抑制劑，但是這些抑制Cas12a的蛋白是迄今為止已知的首批阻斷Cas12a的蛋白。相關研究結果於2018年9月6日在線發表在Science期刊上，論文標題分別為「Systematic discovery of natural CRISPR-Cas12a inhibitors」和「Discovery of widespread Type I and Type V CRISPR-Cas inhibitors」。
在第一項新的研究中，來自美國加州大學伯克利分校的研究人員利用一種全面的生物學信息學和實驗篩選方法鑑定出三種阻斷或減少在人細胞中進行CRISPR/Cas12a介導的基因組編輯的抑制劑。他們還發現CRISPR自我靶向和抑制劑出現率在原核生物基因組中存在廣泛的關聯性，這提示著一種從微生物世界中發現更多的Acr蛋白的直接途徑。
圖片來自Cell, doi:10.1016/j.cell.2016.12.038。
在第二項新的研究中，來自美國加州大學舊金山分校、麻省總醫院和哈佛醫學院的研究人員發現了12個Acr基因，這些基因編碼的Acr蛋白包括抑制V-A型CRISPR/Cas系統和I-C型CRISPR/Cas系統的蛋白，如AcrVA1。
值得注意的是，當在人細胞中進行測試時，AcrVA1最為有效地抑制Cas12a的一系列直向同源物，包括MbCas12a、Mb3Cas12a、AsCas12a和LbCas12a。這項研究發現的這12個Acr基因提供了有用的對CRISPR基因編輯進行控制的生物技術工具。 （生物谷 Bioon.com）
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