逆轉錄酶通常具有多種活性，如逆轉錄活性、複製活性與RNA酶H活性。逆轉錄活性可以RNA為模板，合成與其序列互補的DNA鏈，生成DNA-RNA雜合雙鏈。RNA酶H活性可以水解雜合雙鏈中的RNA，得到與RNA互補的DNA單鏈（cDNA）。複製活性則用來合成雙鏈DNA。
與複製類似，逆轉錄也是由5』向3』合成DNA，要求有模板和不少於四個核苷酸的引物。各種DNA聚合酶活性都需要引物，只有確認引物正確配對，才會進行DNA的合成。這是保證其忠實性的重要手段，逆轉錄酶也不例外。
實驗室合成cDNA時，經常會用合成的寡聚T（oligo dT）作為引物，與mRNA的polyA配對。這個過程比較簡單，因為引物結合在RNA鏈的末端，所以整條鏈的逆轉錄是一次性完成的。
生物體中的逆轉錄過程就比較複雜，比如逆轉錄病毒（retrovirus）。病毒是真正的「極簡風」，所有東西都壓縮到極致。比如它的基因組中，經常有些基因是重疊、嵌套結構，充分利用每一個鹼基。所以它也不會專門編碼一個引發酶來合成引物，它一般是在組裝時帶走宿主的tRNA，在下次侵染時當作引物使用。
被用作引物的tRNA會結合在病毒基因組RNA鏈的中間，所以第一次只能合成出一部分cDNA，然後利用基因組RNA兩端的一段重複序列，「跳」回另一端，完成整條鏈的逆轉錄。
之後水解RNA鏈的時候，會留下一些片段作為複製的引物。雙鏈DNA的合成同樣也需要經過一次跳躍（jump），以合成完整雙鏈。最後兩端具有相同的序列，稱為長末端重複（long terminal repeats，LTR）。LTR不僅包含跳躍時用來配對的序列（圖1中的R），還有整合信號、啟動子、增強子、poly A位點等重要結構。
逆轉錄經常與細胞惡性轉化有關，愛滋病、B肝等很多疾病也有逆轉錄過程。所以相關研究可以為很多疾病的研究和防治提供幫助。逆轉錄酶抑制劑就一直是藥物研發熱點，例如抗HIV的nevirapine（奈韋拉平）。
逆轉錄酶缺乏校對（3'-5'核酸外切酶）功能，所以容易出錯。這也是很多病毒容易突變進化的原因，比如nevirapine就很容易被抵抗。不過，校對功能與逆轉錄活性並不衝突。
有人使用改良的定向進化策略從具有校對功能的DNA聚合酶（古細菌的DNA聚合酶B）進化出高保真的耐熱逆轉錄酶，稱為逆轉錄異種聚合酶（reverse transcription xenopolymerase），證明校對與逆轉錄是兼容的。在科研中，RTX可用於RT-PCR等過程，能夠提高精確度及簡化操作程序（Science. 2016 Jun 24;352 (6293): 1590-3.）。
人體中也有逆轉錄過程，比如端粒的複製。端粒（telomere）是染色體末端的特殊結構，由重複的DNA序列（TTAGGG）和核蛋白組成，可以保護染色體末端，維持基因組完整性。
端粒的末端是單鏈3'末端，形成一種緊湊的T環結構，可保持其穩定性。其表面覆蓋著Shelterin複合物，包括TRF1（端粒重複結合因子1）、TRF2（端粒重複結合因子2）、TIN2（TRF1相互作用核蛋白2）、RAP1（rif相關蛋白）、POT1 （端粒保護）和TPP1（端粒保護蛋白1）
對於線性基因組，其滯後鏈的末端是無法完整複製的，每次約損失30-200個核苷酸（Cells. 2020 Feb 22;9(2).）。這樣隨著細胞分裂，端粒會持續縮短，造成複製性衰老。對於大多數體細胞來說，端粒磨損是一種控制其分裂潛力的機制，但對於需要多次增殖的幹細胞來說，必須設法維持端粒長度。
端粒酶（telomerase）可以通過逆轉錄過程延長端粒。端粒酶由端粒酶RNA（TERC）和端粒酶逆轉錄酶（TERT）組成。TERT使用TERC作為模板，在染色體的單鏈末端合成端粒DNA的重複序列。
大多數體細胞缺乏端粒酶活性，因而容易衰老。但未分化的生殖細胞，幹細胞，活化的淋巴細胞和大多數腫瘤細胞具有高水平的端粒酶活性，可以克服端粒磨損並維持無限的細胞分裂。