5 篇頂級報導，業界傳奇冷凍電鏡技術新突破，如今首次捕獲生命的原子細節，獲利的不僅僅是結構生物學...
l 看清原子，冷凍電鏡開創新的篇章
冷凍電鏡近年來在學術界可謂炙手火熱，頂級 CNS 文章屢見不鮮，不斷掀起結構生物學、藥物研發等領域的認識革新。同時，它也開創了一項學術界傳奇，那就是物理學家斬獲諾貝爾化學獎，獎勵他們幫助生物學家。
2017 年，諾貝爾化學獎被授予瑞士洛桑大學的 Jacques Dubochet、美國哥倫比亞大學的 Joachim Frank 和英國劍橋大學的 Richard Henderson，他們的獲獎理由是「研發冷凍電子顯微鏡，用於測定溶液中生物大分子高解析度結構」。
三年後，冷凍電鏡技術完成了劃時代的突破，首次達到了原子解析度。即利用該技術能清楚地看見大分子量蛋白三維結構的原子種類和分布。冷凍電鏡技術的突破，將不僅僅在結構生物學引起一場風暴，也將對相關研究領域起到重要的推動作用。對於理解蛋白質催化的化學反應的機理以及研究藥物如何結合和幹擾蛋白質的功能至關重要，對基於結構的藥物設計有畫龍點睛之效。2020 年 10 月 21 日，Nature 「背靠背」在線發表了兩篇文章，將人們利用冷凍電鏡的觀測精度擴展到了原子解析度級別。德國馬普生物物理化學研究所結構動力學系 Holger Stark 課題組發表了題為 Breaking the next Cryo-EM resolution barrier – Atomic resolution determination of proteins! 的文章，實現了對去鐵鐵蛋白（apoferritin）結構在原子級別的解析度（1.25Å）的解析。另一項研究則由英國醫學研究委員會分子生物學實驗室（MRC-LMB）的結構生物學家 Sjors Scheres 和 Radu Aricescu 所領銜的團隊完成，該團隊在 1.2Å 的解析度上重建了小鼠去鐵鐵蛋白（mouse apoferritin）的結構。Mark A. Herzik 在 Nature 發表題為 Cryo-electron microscopy reaches atomic resolution 的點評文章，進行了系統評述。此外 Science 也刊發了對這項技術進行了解讀。這同一天發表於 Nature 的兩篇文章，充滿著奇妙的緣分。Yip 和 Nakane 以及他們的合作夥伴們在這場技術革命中起到了居功至偉的作用，他們獲得了解析度高達 1.2 Å 的脫鐵鐵蛋白結構，使蛋白質的單個原子可視化得以實現。而這項史無前例的壯舉在十年前被認為是不可能被實現的。在這可媲美 X 射線晶體衍射技術、高達 1.2 Å 的解析度加持下，該蛋白結構碳、氮、氧原子清晰可見，與藍色的電子密度圖得到了完美的契合。完整的膜蛋白結晶，大而動態的複合物機器，使得冷凍電鏡技術獲得蛋白結構充滿挑戰。Yip 和 Nakane 等人對冷凍電鏡技術進行了革新，利用硬體升級、加速樣品採集與改善樣品質量相融合的方法，實現了冷凍 - EM 密度圖質量的顯著提高，為在常規小分子調節劑高通量篩選和基於結構的藥物發現中常規應用 cryo-EM 提供了一條途徑。目前，這項技術只適用於異常堅硬的蛋白質（proteins that are unusually rigid）。接下來，研究人員將努力用剛性較低的大型蛋白質複合物來達到類似的高解析度，如剪接體。剪接體是一種大型的蛋白質和 RNA 分子複合物，它切斷了 RNA 中命中要轉化為蛋白質的「內含子」。Cryo–electron microscopy reveals the atomic details of apoferritin, a hollow, spherically shaped protein complex that stores iron.一直以來，核磁共振（NMR）光譜，X 射線晶體學和冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）作為結構生物學研究中的三大技術馬車，為解析蛋白、核酸的結構，進而解釋生物大分子的三維結構及其動態變化立下汗馬功勞。結構生物學起源於利用 X 射線晶體學獲得第一個蛋白質結構血紅蛋白和 DNA 雙螺旋結構，且均榮膺諾貝爾獎，從此生命科學的研究正式進入分子生物學時代。數十年來，以結構生物學為依託發現的研究成果，像閃耀的明星，頻頻出現在諾貝爾獎項的舞臺上。與核磁共振（NMR）光譜和 X 射線晶體學技術相比，cryo-EM 已成為確定大型動態複合物結構的關鍵技術，即在沒有結晶的情況下確定生物大分子的原子結構，彌補了前者的技術瓶頸，使得解析高解析度生物大分子複合物的三維結構變得更為容易和常規。1968 年，D.J. De Rosier 和 Aaron Klug 在 Nature 上發表了一篇關於利用電子顯微鏡照片重構 T4 噬菌體尾部三維結構的著名論文，Aaron Klug 本人於 1982 年獲得諾貝爾化學獎。1974 年，Kenneth A. Taylor 和 Robert M. Glaeser 於 1974 年提出了冷凍電鏡技術，並且用於實驗研究。2013 年加州大學舊金山分校 (UCSF) 程亦凡和 David Julius 的研究組首次得到膜蛋白 TRPV1 的 3.4 Å 近原子級別高解析度三維結構，結果發表在 Nature 上。這是一項具有裡程碑意義的研究成果。近年來，越來越多蛋白質或複合蛋白質結構解析領域被稱為諾貝爾獎級別的論文陸續發表，背後的利器正是冷凍電鏡。進入 21 世紀後，利用冷凍電鏡技術發表的文章呈現井噴式增長。2015 年，Nature 雜誌旗下的子刊 Nature method 將冷凍電鏡技術評為年度最受關注技術。冷凍電鏡在技術層面的發展無疑是飛速的，也有越來越多的通過冷凍電鏡技術得到的研究成果發表在高水平的期刊上。以世界著名結構生物學家施一公教授的課題組為例，近兩年來利用冷凍電鏡技術在國際頂尖期刊上發文章到手軟，極大地推動了我國結構生物學學科的發展。之前，冷凍電鏡對更為複雜的結構並沒有很好的處理方式，在一些分子量比較大，包含多層的病毒結構研究中，一直沒有高解析度的三維模型，使得科學家們對於病毒的認識受限。然而隨著冷凍電鏡技術突飛猛進的發展，它開始在藥物設計、疫苗開發領域大放異彩。由冷凍電鏡技術解析的結構為複雜的生化過程的分子機理提供了前所未有的認知，對藥物發現產生了深遠的影響，通過結構推知功能，結合典型藥物的作用方式和作用機制，定向設計和開發高度精準性的新藥，達到精準治療的目標。2019 年，中國科學家利用冷凍電鏡技術解析到世界上目前解析度最高的豬瘟病毒結構，助力科研人員了解該病毒的發病機理、更好地開發疫苗，為我國養豬業和人民食品安全保駕護航。冷凍電鏡技術作為一門交叉學科，其技術突破必將給生物、物理、材料、精準醫學等領域帶來了一場大風暴，未來大有可為。驚豔的技術背後，冷凍電鏡技術仍然距離多數科研工作者比較遙遠，距離「走入尋常百姓家」仍有距離。1. 製備高質量的的樣本，即如何保證樣品分子顆粒均一的分布在厚度恰當的玻璃態冰層中決定著實驗結果的成敗，例如膜蛋白的獲取對結構解析起著關鍵作用；模型三維重構和優化、計算軟體的更新換代需要分析人員紮實的理論基礎；2. 冷凍一般高端冷凍電鏡價格都在 3000 萬人民幣以上，還不包括需要額外配備的近 400 萬人民幣的 K2 相機。且冷凍電鏡一年的運行維護保養成本也有 300 萬左右。電鏡購買和操作成本，目前對於大多數機構來說都是遙不可及。3. 並不是回答每個生物學問題都需要利用到冷凍電鏡技術，且該技術對目標蛋白的性質有要求，例如解析剪接體、蛋白 - RNA 複合物結構時難度較大，但技術革命可以限制大分子三維結構中的不準確性，並為理解生物學功能提供更好的平臺。如何使冷凍電鏡技術走下雲端，回到地面，適用於研究各種生物問題，我們需要走的路還很遠。1.https://www.nature.com/articles/s41586-020-2829-0 2.https://www.nature.com/articles/s41586-020-2833-4 3.https://www.nature.com/articles/d41586-020-02924-y 4.https://www.sciencemag.org/news/2020/10/cryo-electron-microscopy-breaks-atomic-resolution-barrier-last5. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27238019/6. doi:10.1126/science.abf3697傳播有價值的學術報導，解讀有深度的學術文章
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