R plus 生物~Bioconductor

今天是生信星球陪你的第120天

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   終於你跨越茫茫宇宙，來到生信星球，發現了初學者的新大陸

豆豆寫於18.9.7 晚

各行各業數據呈爆炸式增長，大量的數據等待被處理，R語言就是一個利器，可以說是做數據分析必備的程式語言。當強大的R與包羅萬象的生物結合，再一次刺激了R的迅猛發展。隨著NGS測序的普及，R語言的生信專業社區Bioconductor誕生，開啟了生物信息的R語言時代。
好工具，用起來，首先要了解生物數據與R之間的關聯

. 生物知識回顧

基因有三類：第一類編碼序列，編碼蛋白【轉錄+翻譯功能】；第二類只有轉錄沒有翻譯功能【tRNA+rRNA】；第三類不轉錄基因，調控基因表達【啟動子、操縱子】

基因組：單倍體細胞中包含編碼序列和非編碼序列的全部DNA【核基因組+線粒體基因組+葉綠體基因組】

狹義轉錄組：mRNA，代表樣本整體基因表達水平，一般稱為「表達譜」【真正的表達譜是蛋白質組信息，研究手段是質譜】。通常用基因晶片、RNA-seq

廣義轉錄組：

非編碼ncRNA：有三類【按長度劃分】

小於50nt的small RNA【長度單位：單鏈叫nt，雙鏈叫bp】：miRNA、siRNA、piRNA【small RNA序列短，同源性高，一般採用二代測序檢測】

50-500nt：rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA

大於500nt：mRNA-like ncRNA、不帶polyA尾的ncRNA

microRNA：也叫miRNAs，20-25nt，初級轉錄物-》核酸酶剪切加工-〉組裝進RNA誘導的沉默複合體-》互補配對識別靶mRNA-〉根據互補程度不同指導沉默複合體降解靶mRNA或者阻遏mRNA翻譯

DNA、蛋白互作：Chromatin immuopre-cipitation, ChIP，主要應用於：DNA序列轉錄因子結合位點（Binding sites）識別 ，如啟動子、增強子等順式作用文件(Cis-acting element)的識別；DNA甲基化、組蛋白修飾、核小體定位

DNA甲基化：甲基化DNA免疫共沉澱測序(Methylated DNA immunoprecipitation sequencing, MeDIP-seq)、甲基化DNA（蛋白）結合域測序(Methylated DNA binding domain sequencing, MBD-seq)和亞硫酸氫鹽測序(Bisulfite sequencing, BS-seq)

. 基因表達分析基因表達檢測方法

實時螢光定量PCR(Quantitative real time PCR, qRT-PCR)

基因（表達譜）晶片（Microarray）

表達序列標籤（Expressed Sequence Tag, EST）

基因表達系列分析(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE)

轉錄組測序

PCR技術應用最為成熟，靈敏度高，特異性強，但其缺點是通量較小；基因晶片方便快捷，適合臨床診斷及個體基因組分析；基因測序技術通量高，但周期長、成本高

基因晶片是什麼

基因晶片又稱DNA微陣列，按照檢測物的不同，可分為DNA晶片、RNA晶片等，其中DNA晶片又可分為單核苷酸多肽性（SNP）晶片、比較基因組雜交（CGH）晶片等。

原理：基於A、T；C、G互補理論，將已知序列的核酸探針與未知序列的核酸序列進行雜交檢測DNA，並且DNA探針以顯微列印的方式大規模集成於晶片（類似於計算機的矽晶片）表面。雜交後通過計算機對雜交信號的檢測分析，得出樣品的遺傳信息(基因序列及表達的信息)。分析單核苷酸變異多態性性價比較高。

基因晶片原理
主流寡聚核苷酸晶片主要有：Affymetric、Agilen、Illumina公司基因表達數據

矩陣表示：行名代表一個基因不同條件/樣本的表達，列名代表某個條件/樣本的所有基因表達。數據代表表達水平。那麼一般分析什麼？

不同樣本/處理中哪些基因表達有顯著差異？

基因之間有什麼共有的功能，或者參與哪些共同代謝途徑？

不同的處理中，哪些基因變化一致，它們受到上遊哪些基因的調節，或者它們控制下遊哪些基因的表達？

哪些基因表達存在樣本特異性，也就是說通過他們的表達可以判斷樣本的狀態（如：細胞的增殖、分化、凋亡、應激、癌變等）

主要的分析

主要有差異顯著性分析和時間序列分析，後者主要是測定基因多個時間點的表達量，然後聚類+主成分分析尋找共調控基因

表達顯著性分析就是為了找差異基因（DEG）。那麼怎樣判斷基因間是有差異的呢？常用的有3種算法：一是倍數分析（無統計假設），計算每個基因在不同條件/樣本的比值，再與閾值比較；二是用統計模型T檢驗等方法，計算差異表達的置信度p值，以0.05或者0.01作為閾值；三是機器學習方法，利用貝葉斯模型、隨機森林等。分析的結果從來不用擔心沒有差異基因，而是要考慮差異基因可能存在很多，從幾十個到上百個不等，那麼如何展示他們呢，一張簡單粗暴的大表格嗎？肯定是不行的！

需要把上遊的這些差異基因再進行注釋、分組，一個類別就相當於一個GO term，然後看這幾大類的區別，肯定比看幾十甚至上百個基因或蛋白的差異要更加直觀，這就是富集分析，包括GO分析，KEGG分析，GSEA分析等。其中重點研究的基因集叫做前景基因，需要比對的所有基因集叫背景基因，前景是背景的子集。例如轉錄組數據中的對照組和處理組，處理與對照之間的差異基因就是前景基因，兩組所有的表達基因就是背景基因。富集分析的目的就是根據不同功能，把各個分子進行分類，然後使用超幾何分布檢驗進行分析。當然使用不同工具，得到的結果不同，現在clusterProfiler要比DAVID的結果更多。

GO分析（Gene Ontology）

包括GO terms（標籤）+GO annotations（注釋）。

GO terms存在於由基因本體聯合會(Gene Ontology Consortium)建立的資料庫中，對基因和蛋白功能進行限定和描述，每個注釋信息都有一個GO ID。它由兩部分構成，第一部分都是GO，第二部分是以0開頭的7位數字，例如GO:0016021 。

GO是一個情報員，他負責調查：包括基因的分子功能：「幹啥的」（molecular function，MF），指分子所執行的任務【如與碳水化合物結合或ATP水解酶活性等】、細胞組分：「活動區域」即產物發揮作用的位置（cellular component，CC）【如核仁、端粒和識別起始的複合物】、參與的生物過程：「近期有什麼動靜」（biological process，BP）【嘌呤代謝、有絲分裂等】GO調查完就給被查對象貼標籤term

GO annotations即GO注釋，是針對基因產物的而不是基因，表示某些基因的產物是是非編碼RNA、蛋白質還是大分子等。這裡GO就相當於一個中間媒介，它對基因進行定義GO term，然後其他各個資料庫使用GO的定義方法，對它們的基因產物進行標註，例如一個資料庫的EntrezID或SYMBOL與GO資料庫進行ID對應，或者用一個資料庫的序列與GO term進行對應。

在一個GO注釋中，例如，一個基因的產物是細胞色素c（cytochrome c），那麼這個基因的產物就會被一個分子功能術語（Molecular Function）描述為氧化還原酶活性（oxidoreductase activity ），被生物過程（Biological Process）描述為氧化磷酸化（oxidative phosphorylation ），被細胞成分（Cellular Component ）描述為線性體基質（mitochondrial matrix ）和線粒體內膜（mitochondrial inner membrane ）~引用自「讀研筆記」

pathway代謝通路

GO負責分門別類，而pathway負責把每一類對應到具體的代謝網絡中。研究pathway的原因是：生物學問題中設定一個「蝴蝶效應」假設：1個Pathway上遊基因的改變，會導致下遊相關基因改變，從而改變通路中大量基因的表達。現在常用是KEGG，但是它收錄的都是是已有的研究結果，而這些信息，還沒有完善

. 熟悉一下Bioconductor

Bioconductor擁有上千個擴展包，主要有實驗數據包、軟體包、注釋數據包三大類，例如白血病的ALL包就是利用Affymetrix進行晶片分析的數據包；但最重要的當屬軟體包

軟體包：

1 . 注釋：GO、Pathway等

2 . 微陣列板塊（Assay Domains）：處理晶片數據，Bioconductor支持主流的Affymetrix的商業化單色寡聚核苷酸晶片，也支持用戶定製的雙色cDNA晶片。晶片數據一般流程：數據預處理、差異表達基因篩選、聚類分析。這裡的包有以下幾部分：

比較基因組雜交（Comparative Genomic Hybridization, CGH）

細胞水平檢測（Cell Based Assays）

染色質免疫共沉澱晶片（ChIPchip）

拷貝數變異（Copy Number Variants）

CpG島（CpGIsland）

差異表達（Differential Expression）

DNA甲基化（DNA Methylation）

外顯子檢測（Exon Assay）

基因表達（Gene Expression）

遺傳變異性（Genetic Variability）

單核苷酸多態性（SNP）

轉錄

3 . 測序技術（Assay techs）

4 . 數據處理：基因晶片數據預處理（背景矯正、歸一化、質控）、晶片分析、基因間關係、樣本間關係、識別差異基因

聚類分析（Clustering）、分類（Classification）、富集分析（Enrichment）、多組比較（Multiple Comparison）、預處理（Preprocessing）、質控、序列匹配、時間序列分析（Time Course）、可視化、網絡分析

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