雙頭連體姐妹，背後有怎樣的科學？" style="margin: 1em auto; padding: 0px; border: 0px; font-style: inherit; font-variant: inherit; font-weight: inherit; font-stretch: inherit; font-size: inherit; line-height: inherit; font-family: inherit; vertical-align: baseline; max-width: 100%; display: block; border-radius: 4px;" />
文 | 饒毅（北京大學講席教授） 來源 | 知識分子公眾號
導語
最近，美國雙頭女孩Abigail (「Abby」) Hensel和Brittany Hensel的錄像在微信裡廣為傳播。她們1990年3月7日出生於美國明尼蘇達州。我第一次知道她們，是看到1996年3月25日美國《時代》周刊登出她們的故事和照片，那時她們只有六歲。
而我於1991年至1994年在哈佛大學做博士後的實驗室，研究內容包括雙頭的蝌蚪，所以對這一現象的生物學問題很感興趣。必須承認，那時沒有想到她們能長這麼大。事實上，她們做過多次手術。如果沒有現代醫學，恐怕很難存活很長時間。她們還於2012年讀完了大學。
她們有兩個完全分開的頭，分別控制一隻手、一條腿。她們有兩個胃、一個肝、一條小腸、一條大腸，兩個心臟、但循環系統是相通的，三個腎臟，一套生殖器官。因此，出生時如果要分開的話，其中一個很可能立即死去。她們有不同的特長和愛好，當然合作很好，比如開車、打球。
胚胎發生過程中，怎麼出現連體，這是科學問題，而且目前只有部分理解，並非全部理解。我給北大生物大一學生課程《生物學概念與途徑》中有一章專門講這一現象。
自然界連體人極為罕見（圖1）。十九世紀末實驗胚胎學的誕生，卻使人類在實驗室得到連體動物；二十世紀末分子生物學的推進，一個學生一天可以注射特定分子製造成千的連體蝌蚪（圖1）。連體胚胎反映了什麼的生物學問題？研究它有什麼意義？
圖1 連體現象
左，連體人（華裔美籍泰人Chang and Eng Bunkers，1811-1874）；
右，連體蝌蚪（來自賓州大學Peter Klein）
發育生物學是研究一個細胞如何變成一個成體，並進一步變化直到死亡，包括細胞分裂、分化、生長、存活，組織和器官的形成和再生，個體的發育和衰老。發育生物學以前主要是研究胚胎發育，現在也研究超出胚胎基礎過程的幹細胞。而常為人類關心的組織、器官再生問題，缺乏基礎研究的突破，有應用價值的結果更是微乎其微。發育生物學研究方法以前為簡單的切割等操作，現代更多用分子生物學手段，也與物理和化學交叉。
1預成論與後成論的爭論
動物的胚胎如何發育，曾有預成論（preformation）與後成論（epigenesis）的長期爭論。預成論認為卵細胞（或精子、或受精卵）從開始就已形成了動物的各個部分，發育只是展開已有結構；而後成論認為受精卵並無成年的結構，在發育過程中才逐漸形成身體結構。
希波克拉底（Hippocrates of Cos，公元前460年-公元前370年）曾有類似預成論的觀點：「胚胎中所有的部分都是同時形成，所有的肢體相互分開並獨自生長，無一在其他之前或之後，而是那些較大的出現於較小的之前，並非更早形成」。（Needham，1959）。
亞里斯多德（Aristotle，公元前384年-公元前322年）將預成論與後成論作為解釋胚胎發育的兩種對立概念。在《動物形成》一書中，他寫道：「要麼所有身體部件，如心、肺、肝、眼及其它皆同時形成或逐漸形成」。亞里斯多德反對預成論：「前者顯而易見是不對的，因為有些部件在胚胎已經清晰可見，而有些並非如此，且不是因為它們太小，比如肺比心大，但其發育出現晚於心……，那麼這就很明顯，雖然有些東西製造部件，但非確定的物體，也不在精子中完整存在」。他支持後成論：「原則上，自然界一件東西來源於另外一件潛在可以成為最終產物的東西……」。
後成論的支持者包括英國的哈維（William Harvey，1578-1657）、法國的笛卡爾（Rene Descartes，1596-1650）等，預成論的支持者包括義大利的馬爾切洛·馬爾皮吉（Marcello Malpighi，1628-1694）、荷蘭的列文胡克（Antonie van Leeuwenhoek，1632-1723）、德國的萊布尼茨（Gottfried Wilhelm von Leibniz，1646-1716）等。
馬爾皮吉於1673年再啟爭論，到18世紀預成論被認為定論（Meyer，1931；Needham，1959）。荷蘭顯微鏡專家尼古拉斯·哈特蘇克（Nicolaas Hartsoeker，1656-1725）設想如果在顯微鏡下可以看到精子顯示人體所有部分，可能的畫面如圖2。此圖在被誤認為是他的觀察而非其設想的情況下廣為傳播（Hill, 1985）。如果精子有整個人體，那麼發育不過是長大，而無需形成新的結構，甚至早先的人（比如傳說的亞當或夏娃）應該有所有現代人類的個體。當時預成論廣為接受，爭論不過是預成於卵子，還是精子。
圖2 想像精子中的小人
Hartsoeker 於1694年描繪如果精子中有預成的小人可能的樣子。
德國的卡斯帕爾·沃爾弗（Caspar Friedrich Wolff，1733-1794）觀察雞胚發育。他於1759年在《發生理論》的論文中重提後成論，並敘述雞胚在原本勻質的表面逐漸形成血管。1768年他在《小腸形成》一書中描述雞胚的腸子從一片組織摺疊形成，所以血管和小腸皆非預先形成，而是逐漸形成。沃爾弗的結果推翻了傳統的預成論（Meyer，1931；Needham，1959）。
2自分化與依賴性分化
十九世紀後期，德國科學家威罕·儒斯（Wilhelm Roux，1850-1924）區分兩種觀點：「不同部分的自分化」以及「不同部分的分化性相互作用」。儒斯稱自己的研究為「發育成因學」（Entwicklungsmechanik）（Sander，1991a）。以前的科學家包括他的老師恩斯特·海克爾（Ernst Haeckel，1834-1919），對胚胎的研究依賴於觀察，在描述的基礎上提出理論；而德國的奧斯卡·赫特維希（Oskar Hertwig，1849-1922）、法國的勞倫特·查貝裡（Laurent Chabry，1855-1893）等開始了實驗研究（Fischer, 1990; Sander，1991a）；儒斯提倡分析性實驗，不僅要有實驗結果，還要思考結果、檢驗理論（Sander，1991a；Hamburger, 1997）。他們開創的學科到二十世紀被稱為「實驗胚胎學」（Experimental Embryology）。
儒斯選擇了重要「自分化」還是「依賴性」分化作為研究的問題，實驗模型用兩棲類胚胎。1888年，他發表了對蛙胚研究的結果和結論。他集中研究受精卵第一次分裂後成為的兩個細胞是自主發育，還是相互依賴。為此，他在受精卵分裂後，用加熱的針「殺死」其中一個細胞，觀察未受針刺的細胞如何發育，他觀察到剩下的細胞本身繼續分裂，發育後形成半個胚胎（圖3），據此儒斯認為最初兩個細胞之一的失去並不影響另外一個細胞的發育，所以兩個細胞發育是獨立的（Roux，1888）。
圖3 Roux的熱針殺死細胞實驗
上排為示意圖，下排為Roux的結果，引自Sander，1991b。
德國的漢斯·杜裡舒（Hans Driesch，1867-1941）曾於1887—1889年師從海克爾。為了驗證儒斯的結論，杜裡舒在義大利Naples海洋生物實驗站用海膽胚胎做實驗。此前已知搖晃海膽的受精卵可以出現脫落的情況，杜裡舒在海膽受精卵分裂到兩個細胞的時期，搖晃海膽幾分鐘，有些海膽胚胎的兩個細胞會分開，杜裡舒將它們分別培養，然後觀察分開的兩個細胞如何發育。與儒斯結論的預計不同，分開的兩個細胞分別形成兩個完整的，體積只有正常一半大小的胚胎。如果在卵受精後分裂兩次變成四個細胞時再搖晃，四個細胞都分別獨立形成完整的胚胎（Driesch，1891）（圖4）。這些結果顯示了「調節」現象：胚胎的部分可以變成整體。對調節的解釋說明：在胚胎兩細胞期（或四細胞期），每個細胞都具有形成完整胚胎的潛力，但它們的相互作用導致每個細胞在其他細胞存在的情況下分別只參與形成半個胚胎（或四分之一個胚胎）。也就是說，細胞之間一定有相互作用。
圖4 Driesch的海膽胚胎細胞分開培養實驗
左為兩細胞期分開實驗的示意圖（自Hamburger，1988）；右為四細胞期分開的示意圖。
儒斯和杜裡舒等人創造了發育生物學的第一個高峰。儒斯啟迪了思路、開創了途徑，杜裡舒有更嚴格的實驗和分析。儒斯未接受杜裡舒結果的重要性，認為低等的無脊椎動物海膽所得到的結論不如脊椎動物可靠。
1893年，德國動物學家奧斯卡·赫特維希（Oscar Hertwig）最早試圖用絲線分開兩細胞期蛙胚的兩個細胞（constriction，結紮實驗）未能成功（Beetschen, 1996）。美國的摩爾根（1895）、義大利的赫利茲卡（1895）、德國的恩德斯 (1896)等曾有類似工作。德國的漢斯·斯佩曼（Hans Spemann, 1869-1941）在維爾茨堡大學（University of Wurzburg）隨西奧多·博韋裡（Theodor Boveri)做研究生，1895年獲博士學位。斯佩曼在赫特維希、恩德斯等人的基礎上，在蠑螈受精卵第一次分裂後，用頭髮把兩個細胞分開，結果兩個細胞分別獨立地形成完整的蝌蚪，證明脊椎動物胚胎的細胞也有相互作用（Spemann，1901，1902，1903）（圖5左）。
圖5 斯佩曼的結紮實驗。
左為斯佩曼於1903年獲得的結果（來源於Spemann，1903）；中上示意當分裂的平面真好在身體左右之間，右上為中上所示切分方式的結果；中下示意分裂平面為腹背，右下為中下所示切分方式的結果（來源於Spemann，1924）。
斯佩曼發現結紮是否導致兩個完整胚胎形成取決於胚胎第一次細胞分裂的平面（圖5中和右）。如果分裂平面與胚胎未來左右相應，分開的兩個皆完整胚胎。如果分裂平面與背腹相應時，背側部分也可以形成一個幾乎完整的胚胎（含神經系統等重要結構），而腹側部分只能形成皮膚等結構，但不形成完整的胚胎，說明胚胎具有腹側和背側的不對稱性。斯佩曼認為腹側缺乏某種「分化物質」。這種物質可能是器官形成或釋放所需的未組織的物質，也可能是有組織的胚胎物質，它具有分化為各種器官的能力，或者引導其它細胞分化（Spemann，1901； Hamburger，1988）。因此，這是可能包括胚胎背側含有誘導其他細胞分化物質想法的雛形。
3晶狀體誘導
器官中不同部件優美地配合，既是進化的奇妙，也是發育的奧秘。不同部件是否在發育中有相互關係？例如：美妙的眼睛中，晶狀體（lens）在解剖上位於視網膜前特定部位，功能上調節光線準確地投射到視網膜。那麼在發育過程中，晶狀體與視網膜的發育前體結構——視杯（optic cup，亦稱optic vesicle）是否相關？比如空間、時間的協調，是否有依賴關係？
1901至1912年，斯佩曼曾研究晶狀體形成，認為在發育早期，視杯誘導晶狀體產生。支持誘導機理的實驗包括：斯佩曼於二十世紀初報導在去除視杯後，晶狀體不能形成（Spemann，1901b）；美國霍普金斯大學的沃倫·劉易斯（Warren Lewis, 1870-1964）發現將原本不形成晶狀體的外胚層移到視杯上方，可以形成晶狀體（Lewis，1904）；劉易斯還發現將視杯移植到其他部位，導致新部位形成晶狀體（Lewis，1906）（圖6）。
其他研究者以及斯佩曼本人還看到有些胚胎晶狀體產生不依賴視杯，當時以為有晶狀體依賴視杯和晶狀體不依賴視杯的兩類胚胎。1980年代後，視杯誘導晶狀體的簡單方式不被認可，而實際上更複雜（Grainger et al., 1988）。對於斯佩曼時代的胚胎學家來說，晶狀體的研究為胚胎誘導的研究埋下了伏筆。
圖6 晶狀體誘導（來自Hamburger，1988）
上圖示晶狀體形成區域與眼杯區域的空間關係和晶狀體誘導實驗的工具；
下左示切除眼杯；
下右示眼杯切除後，晶狀體也不能形成。
4移植實驗
兩棲類胚胎發育最初從一個受精卵，分裂到幾千個細胞皆為裂殖胚（blastula，所含的每個細胞稱為卵裂球（blastomeres），其後為腸胚（gastrula）。在動物極與植物極交界的附近，細胞開始內卷（invagination），為腸胚形成的開始。內卷首先從背側開始，繼而側面，後在腹側，最後形成一圈，為裂殖孔（blastopore），背側內卷時偏動物極的上方部位稱為「背唇」（the Dorsal Blastopore Lip，簡稱the Dorsal Lip）（圖7）。
圖7 背唇
左圖為蛙發育的腸胚初期背唇照片，自Peter Klein；
右圖為Morgan（1905）示意的截面圖。
十九世紀儒斯與杜裡舒等實驗對象為裂殖胚。斯佩曼將結紮實驗延伸到不同的胚胎發育期，發現一直到腸胚期，如果分開背腹部分都有差別。分離的腹側部只能形成皮膚和腹側及側面中胚層組織入血液和間充質等。分離的背側部產生神經系統和背側的中胚層結構如脊索、體節，在分離時，背側部分含背唇。
儒斯和摩爾根認為胚胎早期赤道部分對發育很重要，儒斯還認為背唇可以產生背側的外胚層結構神經管（Roux, 1892; Morgan, 1894; Lewis, 1907）。1907年，霍普金斯大學的劉易斯將腸胚期的背唇從一個供體胚胎移植到發育更晚期的宿主胚胎，結果發現宿主胚胎因為移植而出現背側中胚層組織脊索和肌肉，及外胚層組織神經管（圖8）。劉易斯認為，來自供體胚胎的背唇被移植到宿主的後自主形成了中胚層和外胚層組織，因為背唇的發育命運已經被決定了（Lewis，1907），也就是背唇自主發育為脊索、肌肉和神經管，其中沒有因背唇誘導宿主而產生的結構。
圖8 背唇移植的後果
腸胚期背唇移植到tailbud期蛙胚7天後，觀察到脊索（c）、肌肉（m）和神經（n）組織。來自Lewis，1907。
1916年，斯佩曼利用常見蠑螈（Triturus Taeniatus）每個胚胎著色的自然差別，在兩個同種蠑螈胚胎之間進行移植，通過著色深淺跟蹤移植的供體在宿主胚胎中的發育命運。他發現腸胚期神經前體區域如果移植到另一胚胎的表皮區域，會形成表皮，而腸胚的表皮區域移植到神經區域會形成神經，都不按供體原有命運，而按被移植到的宿主區域改變了發育命運，說明在移植前它們的命運沒有固定，而被新鄰居所影響後再固定（Spemann，1916，1918，1919）。
斯佩曼用蠑螈重複了劉易斯蛙的背唇移植實驗，獲得兩根背軸。最初記錄在他1916年4月20日的筆記中（Fäler，1996），1918年，他發表了兩根背軸分別含神經管、脊髓的研究（圖9）（Spemann，1918）。
圖9 背唇移植導致第二根神經管形成
同種蠑螈間背唇移植後，形成兩根神經管、兩根脊索。來自Spemann（1918）
但斯佩曼與劉易斯一樣，以為供體的背唇直接成為脊索和神經組織，而未意識到出現了誘導現象。斯佩曼在1918年的文章中還標明第二根神經管來源於移植的背唇（Spemann, 1918；Sander and Fässler，2001）（圖10）。
圖10 Spemann（1918）認為背唇本身直接成為了脊索和神經管。來自Sander and Fässler（2001）
令人驚訝的是，雖然劉易斯和斯佩曼都曾積極研究過晶狀體誘導，試圖用不同方法證明或否定晶狀體是否依賴於視杯，他們兩人皆未考慮第二軸中是否有組織因供體誘導宿主而產生。這在斯佩曼尤為突出，因為他在劉易斯文章九年後發重複性質的文章，而且獲得的第二軸很漂亮。他還是與劉易斯一樣以為背唇成為脊索和神經管。在他1918年文章中，他標註第二根神經管來源於背唇（圖10）(Spemann, 1918; Sander and Fässler, 2001)。斯佩曼的錯誤來源於對背唇命運的錯誤認識。1892年，儒斯的結論是「依據於三種不同的實驗方法，背唇的外表面是神經管的位置」 (Roux, 1892; Sander, 1991c)。斯佩曼因此認為腸胚期的背唇的深層和淺層分別成為脊索和神經管（圖11）(Hamburger, 1988; Fäler，1996)，他稱背唇為「分化中心」（Spemann, 1918）。
圖11 背唇的發育命運
Spemann誤認為背唇內層的命運為中胚層，背唇外層為外胚層(自Hamburger，1988)。
如果斯佩曼仔細分析自己在1918年發表的結果（圖12），可以看到：神經管來源的區域在背唇以上的區域。
圖12 神經管的發育來源
Spemann（1918）結果顯示移植蠑螈腸胚期背唇以上的區域形成神經管。
1919年海德堡大學的漢斯·彼得森（Hans Petersen）在讀到斯佩曼（1918）後，去信斯佩曼指出背唇的表層也應該是中胚層（脊索、體節），而不形成神經管（Spemann, 1921; Hamburger，1988；Sander and Fässler，2001），因此斯佩曼決定要研究背唇移植後導致的第二根背軸中脊索和神經管到底是來自移植供體，還是宿主。斯佩曼於1916和1918年報導的移植是在同種胚胎之間，依賴供體和宿主同種的兩個個體之間自然的色素差異，在分析時不太容易區分。為了確切區分背唇的命運，需要在顏色不同的不同種胚胎之間做背唇移植。1896年，德國猶太科學家古斯塔夫·伯恩（Gustav Born, 1852-1900）首先在異種胚胎間移植，他從一種蛙胚切下一塊移植到另一胚胎上形成嵌合胚胎（chimera）。1898年，美國霍普金斯大學的羅斯·哈裡森（Ross Harrison, 1870-1959）用同樣的方法在不同種、不同色素的蛙之間進行過胚胎組織的移植，可以在移植後發育成的蝌蚪中區分來源於供體和宿主的組織。斯佩曼於1916年做同種移植（homeoplastic transplantation），1917年開始做異種移植（heteroplastic transplantation）。斯佩曼用不同顏色的蠑螈之間進行移植，他常用色淺的Triturus cristatus和色深的Triturus taeniatus（或Triturus alpestris），以便區分供體和宿主來源的胚胎組織。
希爾德·曼戈爾德(Hilde Mangold, 1898-1924）上大學主修自然科學，她在法蘭克福大學聽斯佩曼的學術報告後要求轉學到斯佩曼所在的弗賴堡大學，1920年進斯佩曼實驗室做研究生（Fässler and Sander，1996）。斯佩曼給她的第一個課題是研究水螅（hydra），但實驗遇到問題，斯佩曼也不能解決，再給她的課題是斯佩曼自己做過、所以技術上應該沒有問題：背唇移植。將來源於色淺的T. cristatus的背唇移植到色深的T. taeniatus（或T alpestris）。
在曼戈爾德尚未開始移植實驗的1921年1月，斯佩曼單獨提交的文章寫道：「也許整個移植的背唇屬於…內中胚層…如果這樣的話，從T. taeniatus胚胎來的背唇移植到T. cristatus宿主後，（中胚層的）脊索和體節應該屬於前者，而（外胚層）的神經板屬於後者」（Spemann，1921；Sander and Fässler，2001）。
很可能是在初稿提交後曼戈爾德的移植實驗開始有了結果，斯佩曼將曼戈爾德的一個結果於1921年5月作為後記補錄在斯佩曼（1921）論文中（Spemann， 1921；Sander and Fässler，2001）。曼戈爾德將色淺的T. cristatus腸胚期背唇移植到色深的 T. taeniatus腸胚側面，觀察到第二個背軸產生。1921年，斯佩曼用了組織者（organizer）一詞描述背唇：在它正常存在或者移植到的部位，對未分化材料創造一定方向和程度的「組織場」（Spemann，1921；Hamburger，1988）。
5胚胎誘導與組織者
1921年和1922年，曼戈爾德記錄了259次移植實驗，其中28個宿主胚胎出現第二背軸，當時培養胚胎的溶液欠佳，也無抗生素，所以胚胎在手術後的成活率不高。希爾德於1923年曾與丈夫曼戈爾德合作做移植實驗（217個宿主，其中17個有第二背軸），斯佩曼沒選曼戈爾德夫婦合作獲得的結果（Fässler and Sander，1996）。
1924年，斯佩曼和曼戈爾德發表合作的文章，斯佩曼選擇詳細分析了曼戈爾德獲得的六個胚胎移植的結果（Spemann and Mangold，1924）。文章首先指出蠑螈腸胚化開始時，不同部位的決定性不同，通過移植可以檢驗，發現有些組織移植到其他部位後，其發育命運可以改變，這些工作斯佩曼於1918年和1921年已報導，1922年、1923年得到曼戈爾德的驗證和推廣。然後，他們指出，斯佩曼（1918）發現背唇很不一樣，移植到形成上皮的地方，背唇繼續按自己確定的命運發育，而移植後的區域出現第二個胚胎原基，含神經管、脊索和體節。劉易斯（1907）有類似的發現，只是用腸胚後期的背唇移植到更老一些的胚胎其他部位，觀察到它發育為神經組織和體節。
斯佩曼和曼戈爾德提出發育命運確定在先的區域可以決定其他尚未確定命運區域的發育。他們用的例子是胚胎旋轉的實驗結果。蛙卵細胞有極性，著色深、較輕的為動物極，著色淺、較重的為植物極（圖15），這一極性維持到胚胎發育過程中，精子從動物極進入卵細胞，動物半球主要貢獻於外胚層和中胚層，植物半球主要貢獻於內胚層。1918年，斯佩曼的研究中曾將腸胚的動物極半球、植物半球分開，然後180度或90度旋轉後再重合，結果認為植物極影響動物極的發育。由此，他們用了「組織中心」（organization center）的概念：胚胎中先決定的區域，再送出一定方向和一定量的決定性影響。
他們認為，雖然斯佩曼（1918）發現了胚胎不同區域的決定性不同，但當時只在同種胚胎之間進行移植，不易區分移植的供體與宿主，而異種移植更好，比如將T. cristatus胚胎中確定的區域移植到 T. taeniatus（或T. alpestris）胚胎中未定區域。文章描述的六個移植為1921年的Um8b，和1922年Um25b、Um214、Um131b、Um83b、Um132b。文章只在討論Um25時有文字介紹、而未顯示Um214的圖片，而多個圖片顯示了其他每個移植胚胎在多個部位的切片。
Um8b第二根神經管中很長部分來源於宿主，但有相當部分來源於供體，脊索來自供體；Um25b第二根神經管完全來自於宿主，而脊索完全來源於供體；Um214b的第二根神經管也完全來自於宿主，而脊索完全來源於供體；Um131b的第二根神經管多來自宿主、少數部位細胞來自供體，脊索和體節來自供體；Um83b的第二根神經管來自宿主，體節多數細胞來自宿主，脊索和部分體節來自供體；Um132b第二根神經管多數來自宿主（後2/3部分少數細胞來自供體，皆在神經管的底板），脊索與部分體節來自供體（圖13）。可能是因為Um25b的兩張組織切片的圖不特別好看，所以一般教科書不太用這一最能突出神經管可能由脊索誘導產生的例子，而常用Um132b為例，Um132的第二根神經管比較長，其胚胎在體外培養的時期也較長。
圖13 Um132b第二根神經管的發育來源
左，曼戈爾德原繪圖，胚胎左邊色深的第一根神經管和脊索、體節皆來源於宿主；右邊第二根神經管的大部分細胞來自宿主，脊索來自供體，體節的部分細胞來自供體(自Spemann and Mangold, 1924)。
右，後人拍攝曼戈爾德留下Um132b原切片中第二根神經管及其附近結構的照片。第二根神經管在照片部分看來全是宿主細胞、無供體細胞，脊索全是供體細胞，體節有宿主和供體細胞(自Fässler & Sander, 1996)。
在討論中，斯佩曼和曼戈爾德先談了移植的方向、背唇的具體位置、發育期、第二原基內涵等。在機理討論部分，他們明確提出肯定出現了誘導，但不清楚發生的確切的時間，是否直接誘導，於是提出兩種可能：1）移植供體本身產生少量神經組織並存在於外胚層表面（如Um8b所見），而這些神經組織誘導宿主的細胞成為神經組織；2）中胚層誘導神經組織產生。他們當時的結果不能確定哪種解釋為正確，提出了一些可能的實驗。他們還定義和討論了組織者的概念。
什麼是組織者、組織者如何起作用可能在今天還有爭論，而誘導為後來很多實驗所證明，並不限於胚胎，也不限於發育，是細胞之間相互作用的一種範式。
6餘音繚繞
沃爾瑟·沃格特（Walther Vogt, 1888-1941）從1920年代初開始用染料跟蹤胚胎細胞的命運（1923），並於1925和1929年發表蛙胚的命運圖（fate map）（Vogt, 1929）（圖14）。他的圖譜清楚地顯示背唇本身只成為中胚層，斯佩曼以前以為背唇深層和淺層不同命運，淺層成為神經胚層的想法肯定不對。
圖14 Vogt的命運圖譜
左，裂殖胚或腸胚早期多處放置活體染料；
中，同左的胚胎到蝌蚪期，觀察染料著色的區域成為何種組織、器官；
右，總結背唇的命運為中胚層，而不貢獻於神經板(自Vogt, 1929）。
斯佩曼的研究生約翰內斯·霍爾特弗雷特（Johannes Holtfreter, 1901-1992），曼戈爾德等推進了神經誘導的研究，包括誘導的區域性，建立體外誘導模型等。霍爾特弗雷特實驗室的中國留學生莊孝惠研究了宿主胚胎不同區域對外源性誘導物的反應（Hamburger et al., 1988）。
1919至1924年斯佩曼沒做實驗，1925年重回實驗第一線，1929年開始用不同方法「破壞」背唇的結構（切、壓、加熱、冷凍、乾燥），觀察經過這些處理後，背唇是否還有誘導的活性（Hamburger, 1988），結果多為陰性。霍爾特弗雷特離開斯佩曼實驗室後獨立做過類似的研究，他改進了培養液，大大提高了胚胎的存活率，他發現多種方法處理後的背唇仍然有神經誘導的活性。1932年，斯佩曼與三個學生合作發表了一篇論文，四人分別寫一段（Bautzmann et al., 1932)，其中霍爾特弗雷特一人做過130個胚胎，其他人做過少量的胚胎。赫爾曼·鮑特茲曼（Hermann Bautzmann）觀察到背唇加溫到60度處理5到10分鐘後，還可能有神經誘導活性；霍爾特弗雷特發現背唇在60度乾燥、100度加溫、冷凍後，仍有神經誘導活性；斯佩曼發現背唇用96%的酒精處理3分鐘後，仍有誘導活性，不過他只有一例胚胎；曼戈爾德希望看誘導物質是否可彌散，將背唇附著於瓊脂，乾燥後將瓊脂轉到胚胎，檢驗其誘導性。鮑特茲曼等（1932）證明無需活著的背唇組織或細胞就可能有誘導活性，被認為開啟了胚胎誘導分子的研究。
斯佩曼的研究生埃爾斯·魏赫梅爾（Else Wehmeier）與化學家費舍爾合作，試圖用丙酮、乙醇、乙醚等提取背唇的神經誘導物質（Fischer and Wehmeier，1933）。劍橋大學的李約瑟（Joseph Needham，1900-1995）、多蘿西·尼達姆（Dorothy Needham, 1896-1987）和康拉德·沃丁頓(Conrad Waddington, 1905-1975）研究蠑螈提取物的誘導活性（Waddington et al., 1933; Needham et al., 1934）。但是在這股生化胚胎學（biochemical embryology）的熱潮中，並未得到誘導的分子。
圖15 裂殖胚
著色深的動物極，淺的植物極(自Peter Klein)。
1940年代至1970年代的三十年為胚胎發育研究的寒冷期。其中最重要的是荷蘭烏特勒支大學的Pieter Nieuwkoop於1969年發現中胚層為內胚層誘導所產生。Nieuwkoop將裂殖胚從動物極到植物極分成幾個部分，發現雖然動物極單獨不能形成中胚層，但它如果與植物極共同培養，可以形成中胚層（Nieukwoop，1969a, 1969b, 1970）。進一步通過同位素標記區分供體和宿主證明在植物極與動物極共培養時，中胚層來自動物極，所以是植物極誘導動物極產生中胚層（Nieukwoop and Ubbels，1972）。在正常發育過程中，中胚層之所以在動物極和植物極之間產生，是因為植物極發出信號誘導動物極和植物極之間的結構（摩爾根時代稱赤道區，後稱邊緣區）形成中胚層。
由於背唇神經誘導曾被質問（Jacobson, 1982, 1983），英國兩個實驗室於1983年將辣根過氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）注射到供體胚胎，在腸胚早期獲得背唇，移植到同期宿主的腹側，觀察到第二根背軸，其中HRP只存在於脊索中，而神經管完全來源於宿主（Smith and Slack，1983；Gimlich and Cooke，1983)，從而回答了質疑、再次證實了1924年的結論。
腸胚期胚胎的腹背軸已經形成，因此腸胚背唇移植導致背軸形成的實驗需要在胚胎更早期進行研究。美國伯克利加州大學的約翰·格哈特（John Gerhart）實驗室在64細胞期做移植實驗，發現植物半球背側的單個細胞如果移植到宿主胚胎的腹側，可以誘導第二背軸產生（Gimlich and Gerhart，1984）。實際上，腹背軸的形成可以推早到受精：在受精前，卵細胞無腹背差別，而精子進入導致卵細胞內細胞骨架變化，引起一系列變化，致使精子進入一側為將來胚胎的腹側（Gerhart et al., 1989）。所以，背唇移植實驗延伸出中胚層誘導，腹背軸形成等多個重要問題的研究。
7分子時代
20世紀30年代，科學家沒找到胚胎誘導的相關分子；70年代，以重組DNA為代表的新技術導致分子生物學在生物醫學多個領域得到應用；80至90年代，不同的方法幫助科學家找到了中胚層誘導、背軸誘導和神經誘導的分子，並對神經誘導的機理有新的理解。
因為胚胎植物極有誘導中胚層的活性，哈佛大學的道格拉斯·梅爾頓（Douglas Melton）通過mRNA差異性分布，找到非洲爪蟾卵細胞動物極和植物極分別特有（或富集）的mRNA（Rebagliati et al., 1985），其中植物極特有的Vg-1編碼蛋白質為轉化生長因子（TGF-β）家族的成員（Weeks and Melton，1987）（圖16）。
圖16 Vg-1的mRNA分布富集於植物極(自Rebagliati et al.,1985)
美國舊金山加州大學（UCSF）的基梅爾曼和基施納用裂殖胚的動物極部分（所謂「動物帽」，animal cap）體外培養作為檢測方法，篩查當時已知生長因子的誘導活性。動物帽單獨培養只形成皮膚，而培養時如果存在成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF），可以出現中胚層（特別是腹側和側面的中胚層組織）（Kimelman and Kirschner，1987）。英國的吉姆·史密斯（Jim Smith）發現爪蟾體外培養細胞系的分泌物有中胚層誘導活性（Smith, 1987），以後被證明為Activin、也是TGF-β家族成員。Activin的作用有劑量依賴性，低劑量誘導腹側、側面中胚層，高劑量誘導背側中胚層（如背唇、或其衍化的脊索）。TGF-β家族的骨形成蛋白（BMP，bone morphogenetic protein）可以誘導腹側中胚層產生。
一個偶然的發現開啟了對背軸形成分子機理的理解。研究癌基因的英裔美國分子生物學家安德魯·麥克馬洪（Andrew McMahon）與研究蛙胚的蘭德爾·穆恩（Randall Moon）合作，將認為在老鼠過高或者異位表達導致乳腺癌的int-1基因所轉錄的mRNA注射到爪蟾受精卵，結果胚胎形成兩個背軸 (McMahan and Moon，1989），這一意外的發現當時被認為是「分裂」了組織者，其後認為是激活了背軸形成的通路。從研究病毒導致老鼠癌症發現的int-1與從研究果蠅翅膀形成發現的無翅基因組成Wnt家族，產生分泌型蛋白，Wnt不同成員通過作用於其受體及信號轉導分子參與多個生物學過程。它們在蛙胚中，參與背軸形成，但尚待確定胚胎內從哪一步開始用Wnt信號通路。1992年，伯克利加州大學的英裔美國科學家理察·哈蘭德（Richard Harland）實驗室發現表達於背唇的Noggin基因，編碼分泌型蛋白質也能誘導背軸（Smith and Harland，1992）。
1993年，哈蘭德實驗室發現Noggin有神經誘導的活性（Lamb et al., 1993）。1994年，洛杉磯加州大學的阿根廷裔美國科學家德·羅伯提斯（De Robertis）實驗室發現背唇表達Chordin,也編碼有神經誘導活性的分泌型蛋白質（Sasai et al., 1994）（圖17）。
圖17 背唇表達的Chordin
(自Sasai et al.,1994)。
梅爾頓實驗室的伊朗庫德裔Ali Hemmati-Brivanlou在研究Activin參與中胚層誘導的過程中，用Activin受體製造的抑制分子阻止中胚層形成時，意外發現沒有中胚層仍可出現神經系統，從而提出神經胚層的誘導在分子機理上是去抑制：胚胎內存在抑制神經胚層形成的分子，而如果抑制這些抑制性分子就可以「誘導」神經發生（Hemmati-Brivanlou and Melton, 1994）。抑制分子可能是BMP，而Noggin和Chordin等蛋白質可以直接結合BMP，並抑制BMP的活性（Piccolo et al., 1996；Zimmerman et al., 1996）。
8總結
預成論與後成論的古老爭論，在實驗胚胎學興起後，刺激了人們感興趣研究早期細胞發育是完全獨立自主、還是相互作用。
斯佩曼和曼戈爾德（1924）的研究，實驗設計類似於劉易斯（1907）。斯佩曼曾於1916年、1918年重複劉易斯的工作並沿用其理解，而皮特森於1919年向斯佩曼提出以前對背唇自分化命運的理解可能有問題，加上概念上曾有斯佩曼和劉易斯等在二十世紀初研究晶狀體可能被誘導產生的鋪墊，導致斯佩曼決定採用伯恩（1896）和哈裡森（1898）的方法，通過異種胚胎間移植確切地分清移植提供的背唇自身變成神經管，還是誘導宿主胚胎組織產生神經管，最終斯佩曼指導曼戈爾德的實驗獲得結果提示神經管為背唇誘導所產生。
胚胎誘導的概念，不僅成為核心問題之一主導幾十年的發育生物學研究，也影響了人們思考細胞相互作用所參與的其他生物學過程，但20世紀30年代研究胚胎誘導的分子機理遭遇技術困難，直到上世紀80、90年代才獲突破。
在實驗胚胎學研究過程中多次發現不同方法可以產生連體胚胎，包括結紮實驗、背唇移植實驗、早期裂殖胚細胞移植實驗、Wnt家族分子注射、以及本文未討論的BMP受體抑制劑注射。這些研究幫助我們理解基本的發育生物學機理，但是，迄今並不清楚連體人的發生原因。
圖18 Han Spemann與Hilde Mangold
左，1935年12月10日諾貝爾獎合影：物理得獎者居裡夫人的女兒Irène Juliot-Curie、女婿Frédéric Joliot，生理學獲獎者Spemann；右，Hilde Mangold與幼子。
參考文獻
注1：預成論與後成論部分參考了作者研究生論文：
Rao Y (1991) Molecular and genetic analyses of cellular communication in Drosophila neurogenesis. University of California, San Francisco, California.
注2：對於依賴性分化和自主分化，摩爾根總結為：「分裂的卵之不同部分協同工作、既相互作用形成結果，或分裂導致卵的一部分與另一部分分開而獨立發育？」（Morgan, 1897）。依賴性和自主分化也對應於當時所謂調節性（regulatory）發育和鑲嵌性（mosaic）發育，調節性意味著早期的細胞的命運並未固定、可以變化，鑲嵌性意味著胚胎早期特定的前體細胞（或區域）能、也只能發育為成體特定的細胞（或組織）。現代的術語歸納為：外源性（extrinsic）因素和內源性（intrinsic）因素在胚胎細胞發育過程中起作用。
注3： 德文entwicklungsmechanik英譯常為developmental mechanics、中譯「發育力學」，但Sander認為Roux用mechanik應該是取康德的理解，為「自然的因果」（Sander，1991a），本文採納此說而譯為「發育成因學」。
注4：胚胎和解剖學家Gustav Jacob Born為物理學家Max Born（1882-1970）之父。
注5：華盛頓大學的德裔美國科學家Viktor Hamburger於1988年很好地總結了Spemann的工作，但未提到Spemann and Mangold（1924）原文引用的Lewis（1907）。
注6：Hilde Mangold（圖18右）於1921年23歲生日當天與Otto Mangold結婚，1923年2月提交研究生論文，其後與Otto合作做過更多實驗，包括懷孕期間，實驗記錄於1923年12月兒子出生後停止。不幸的是，1924年9月她在丈夫的農村老家因使用酒精爐為兒子準備食物，酒精外溢燒傷過重而去世（Fässler and Sander，1996），她的獨子在二戰中去世，丈夫Otto Mangold曾接任Spemann的職位，但二戰後作為納粹支持者被冷藏。
注7：Spemann不僅以自己的發現，而且通過一批學生（包括移民美國的Holtfretter和Hamburger），推動了歐洲和美國的發育生物學研究。他於1935年獲諾貝爾獎（圖18），1941年去世。
注8：李約瑟轉行研究中國科技，最終與一些華人和非華裔學者合作寫出Science and Civilization in China。
注9：Waddington於1942年從原意為後成論的epigenesis衍生出epigenetics一詞，當時他定義為「研究基因與其產物相互作用，導致表型產生的學科分支」，但基本涵義為發育，例如他於1952年出版《鳥的epigenetics》一書敘述雞的胚胎發育過程、而非遺傳學。Epigenetics經幾重轉用後成為今天的熱門詞彙「表觀遺傳學」。
注10，在UCLA做博士後期間發表Sasai et al., 1994的第一作者，是日本科學家笹井芳樹(Yoshiki Sasai)，於2014年因為其合作者小保方晴子（Haruko Obokata）被懷疑幹細胞研究造假，而自盡。
更多閱讀請點擊：http://t.cn/RGkqlB4
（責任編輯 葉水送 李曉明）