平凡的中學生鹿目圓（悠木碧 配音）有一個美滿的家庭，在生活中她是個性格溫順又有愛心的好孩子。轉學生曉美焰（齋藤千和 配音）的出現打破了小圓平靜的生活，這個性格酷酷又體弱多病的黑長直少女似乎對小圓有著什麼難言之隱。命運中的相遇出現了，小圓在路邊救下了一隻渾身是傷的奇怪動物 ，沒想到這隻動物居然會說人類的語言。它告訴小圓它的名字叫丘比（加藤英美裡 配音），並且提出了一個特殊的要求，它希望小圓能夠和它籤訂契約成為魔法少女。魔法少女是這個世界中一種特殊的存在，她們肩負著和魔女戰鬥的使命，作為報酬，丘比可以實現她們任意的一個願望。在戰鬥的過程中，小圓發現魔法少女這個職業並非故事裡所描繪的那麼美好，隨時有著犧牲的可能。並且，隨著戰鬥的升級，一個關乎於她自己的殘酷真相正在逐步的浮出水面。
最終小圓許下的願望終結了這個願望。小圓的願望「想在所有魔女產生前就消滅她們，所有宇宙過去與未來的一切魔女都由我消滅」對於Q貝來說已經不是幹涉時間等級的而是已經改變因果了。這個願望中無論是過去還是未來甚至不同宇宙所有的魔女在誕生前都會由小圓消滅掉，那麼著就不再只是簡單的重複某段時間而是穿梭於所有時間段。此時現實的時間停止在一刻，而小圓則穿梭於過去未來各個時間獵殺從過去到未來的所有魔女。就像fate stay night裡時間停留在saber死的那一刻，而saber則穿梭於各個時間尋找聖杯。許願後的小圓其實已然化為新的規則，而對於現實世界時間其實是靜止的，靜止在小圓許願的那個時刻，而作為規則的小圓開始了不同時間點的穿梭。在現實靜止的時間點上，小圓同時出現在了從過去到未來所有存在魔法少女的時間點。就好像對於衛宮士郎來說，亞瑟王早已死在中世紀的樹下，不過這並不妨礙他在20世紀邂逅saber。
小圓穿梭於所有時空給予了歷史和未來所有在絕望中死去的魔法少女以心靈的救贖，然後自己承擔所有的絕望。而這份超越一切的絕望最終讓小圓變為了最大的魔女，但是同時小圓的願望所有魔女在誕生前由自己消滅，所以存在小圓化成的魔女的同時還出現了魔法少女小圓，最終有魔法少女小圓消滅了魔女的自己。同時這也產生了悖論，因為魔法少女小圓轉變成的魔女最終是被「過去」（許願成為魔法少女的時間點）的魔法少女小圓消滅的。許願時的小圓穿梭於所有時間點，自然包括自己變成魔女的時間點，並將自己的未來殺死。悖論的產生導致小圓本身的存在被抹殺，她既沒有出生也沒有消亡過，並且消失於所有人的記憶中，不會有人再記得曾經有這也一個人。
而小圓則化為新的法則本身，可以看到所有時空、所有世界，但是永遠不再能夠對世界產生任何幹涉。新規則誕生後，回到現世，杏子（紅毛）、麻美（黃毛）都復活了，而沙耶加（藍毛）卻變成了因為靈核能量耗盡消失。在另一個世界層面上，小圓對著沙耶加說自己救不了沙耶加，因為救了她，這個未來就不存在。小圓的許願是魔女誕生前由自己消滅，所以魔女不再存在。那麼因魔女而死的杏子和麻美自然不應該死亡，但是沙耶加是變成魔女而死的，那麼根據新的法則，沙耶加在變成魔女前靈核的汙穢由小圓吸走，然後直接死在那個時刻，所以沙耶加無論如何都無法得救。但是沙耶加最後看到愛慕的上條康復後拉奏小提琴，終於可以坦然接受並給予上條和仁美以祝福，所以沙耶加改變了絕望中終結的命運。小圓帶著沙耶加離開則可能意味著，魔法少女消失後會處於與小圓相同的高層次的世界。
本部動畫依據了浮士德、尼伯龍根的指環等。沙耶加的故事其實就是另一種形式美人魚的故事。人魚愛上王子並救了他，但是獲救的王子卻不知道救他的是人魚，而和另外的女人結婚。人魚直到最後也不願意背叛王子於是化為泡沫。沙耶加、上條與仁美得故事大體於此一致，第12集沙耶加消失，而仁美和上條走在一起，可以影射為沙耶加像人魚一樣化為泡沫。而小圓魔女化的名字為瑪格麗特，浮士德的戀人。QB是渴望得到人類靈魂的惡魔孟菲斯託、曉美炎隱射浮士德而小圓則是瑪格麗特。浮士德結局時，跟惡魔孟菲斯託籤訂契約的浮士德，由瑪格麗特帶上天堂。曉美炎最終背負著巨大的絕望黑翅，最後一刻聽到了小圓（瑪格麗特）的聲音，由小圓給予她終結之時，影射的就是浮士德與瑪格麗特的故事。