《液相色譜分析中常見基線問題及案例解析》
色譜分析中基線噪音大、規律性波動和漂移是比較常見的基線問題，這些異常的基線對方法的檢測靈敏度和雜質組分的檢出能力具有很大影響，特別是在樣品純度測試以及痕量殘留物質檢測中，異常的基線將會影響雜質組分和痕量殘留物質的定性和定量。液相色譜中影響基線的因素很多，既會受到儀器硬體，如泵、混合器、燈能量和檢測器等影響，也會受到外界因素，如溫度、流動相組成和使用添加劑等因素的影響。
論壇中關於基線問題的帖子很多，許多老師對基線問題產生的原因及解決方法進行了非常詳細的總結。本貼以Waters e2695和VARIAN LC240為例，例舉了一些在實驗過程中遇到的基線問題以及相應的解決方法，整理出來與各位老師一起分享。
2.1 單向閥對壓力波動和基線的影響
之前採用Waters e2695和2414示差檢測器測定蜂蜜中糖含量的過程中偶爾會出現基線波動異常的情況，並且伴隨著泵節奏發生改變，檢查發現儀器壓力波動異常。
依據以往經驗首先懷疑是流動相中有氣泡，於是停泵、對流動相進行超聲脫氣，然而重新開泵時發現儀器壓力一直很小並且不斷波動，運行一段時間後，泵自動停止運轉並發出警報「lost prime」。
Purge管路中的氣泡，dry prime模式下用針筒抽取管路中的流動相，此時發現沒有流動相流出，於是意識到問題所在。由於採用的是流動相在線混合的方式，其中一個通道走的是純乙腈，該儀器在用到純乙腈或高比例乙腈時單向閥經常會出現問題，據說該故障是由於乙腈發生交聯黏住單向閥中的寶石球引起的。於是根據經驗，對單向閥進行拆卸並超聲清洗。
拆卸單向閥時，由於重力作用流動相會不斷流出（平時使用時流動相放於儀器的上端），要阻止流動相的流動有兩種方法，
（1）直接將管路從流動相瓶中拿出來，但是也會有少量殘餘的液體流出；
（2）關閉GPV（梯度比例閥）。第一種方法簡單粗暴，不用多介紹，著重講一下GPV的關閉方法，見下圖。
關閉GPV之後就可以拆卸單向閥了，Waters e2695有兩個單向閥，任何一個單向閥有問題都會引起壓力波動，因此最好兩個同時進行清洗。單向閥清洗流程：先將單向閥用5％左右硝酸溶液超聲15~30min，然後換用純水超聲15~30min，最後換用甲醇超聲15~30min，如果時間充裕，多超聲一會也無妨。
清洗、安裝好單向閥（安裝時兩個單向閥的箭頭均朝上）後再次在dry prime模式下用針筒抽取管路中的流動相，排除氣泡。排氣結束後重新啟動泵，儀器壓力逐漸變大，系統壓力波動恢復到允許的範圍內，走基線和測定時基線波動有所改善。
2.2 參數設置對基線的影響
有些儀器能夠通過修改靈敏度或者增益等參數影響色譜圖的基線和信號響應。Waters 2414示差檢測器就有這樣的功能，其靈敏度有1~1024共11種選項，同樣以蜂蜜中糖含量測定為例，選擇低、中、高3種模式進行測定，考察靈敏度對基線噪音的影響。
對比不同靈敏度模式下測定的色譜圖、基線噪音和壓力波動可以發現，靈敏度對色譜峰的響應值和基線噪音有很大的影響，靈敏度越大，色譜峰響應值越高，同時基線噪音也越大。
當靈敏度由4變為128時，果糖的響應值也由60MV增加到2000MV，同時基線噪音由2MV左右增加到50MV左右。從壓力波動的圖中可以發現，靈敏度的改變對壓力波動幾乎沒有影響，不同靈敏度模式下壓力波動範圍均維持在20psi左右，可見壓力並不是此次噪音增大的主要因素。
2.3 流動相混合方式對基線的影響
通常液相色譜儀配置高壓二元泵或者低壓四元泵，而泵的衝程體積以及混合器（二元高壓泵）的體積大小均會對色譜基線噪音產生影響，泵的衝程體積越小以及混合器的體積越大，由輸液造成的脈衝相對越小，基線越平穩。
示差檢測器是連續檢測樣品池和參比池間液體折光指數差值的檢測器，該檢測器對流動相的變化和溫度都很敏感，流動相通過比例閥進行在線混合可能導致流動相混合不均勻引起液體折光率產生微弱差異，同時乙腈與水的在線混合也可能引起溫度的變化。
採用單泵預混的方式可以避免上述問題，因此使用示差檢測器時，如果流動相需要用混合溶劑，建議先將流動相進行預混，並採用單一流路的方式運行。實踐證明，採用流動相預混和單一流路的方式基本消除了測糖過程中的基線波動現象。
2.4 氘燈對基線的影響
氘燈是紫外檢測器中非常重要的光學部件，在生產初期就被廠家賦予了一定的生命值，其設計使用時間有500、1000，2000小時等等。當氘燈使用時間超過設計使用時間後就可能出現氘燈能量下降、基線漂移和噪音增大等現象。因此如果實驗中出現基線漂移和噪音增大的情況，有必要去檢查一下氘燈的使用時間和氘燈能量，例如下面的這個案例。
上圖中1是更換氘燈前4種物質的混合標準溶液色譜圖，該色譜圖中4種物質的峰型、響應值、分離度等都還好，但是通過放大圖可以發現，基線噪音還是很明顯的，其基線噪音大約為4×10-4AU(檢定規程要求≤5×10-4AU)，雖然能滿足檢定規程的要求，但是考慮燈的使用時間已經很長，決定還是檢查一下燈能量。
通過檢查發現，該儀器的氘燈已經使用了5038小時（設計使用時間為2000小時，8000為自行修改的數值），氘燈能量約為28000，不僅使用時間大大超過設計使用時間，而且氘燈能量也明顯下降，於是決定對氘燈進行更換。《2998檢測器操作指南》上有詳細的換燈步驟，不多介紹。
上圖是拆卸下來的舊氘燈與新氘燈的對比圖，從圖中可以看到舊氘燈的燈絲附近已經產生非常明顯的「黑眼圈」，顯然是「用眼過度」了。更換完氘燈，在軟體中設置氘燈序列號、安裝日期等信息，檢查、記錄新氘燈的氘燈能量值，已備日後查驗。具體步驟見下圖：
新的氘燈能量約為60000，原先舊氘燈的能量已經下降了一半。安裝好新氘燈後重新對標準溶液進行測試，測試結果如下圖：
通過基線放大圖可以發現，更換氘燈後基線噪音有所改善，其基線噪音大約為5×10-5AU。
2.5 流通池汙染對基線的影響
同樣是上面4種物質的混合標準溶液，進樣之前，在平衡色譜柱的時候發現基線漂的很厲害，進樣後基線波動很大，而且在第4種物質出峰處基線往上漂移，嚴重該物質的影響定性和定量。
通過一系列的排查，排除掉單向閥、色譜柱、流動相和氘燈等因素，最後檢查流通池。由於實驗室有兩臺相同型號的檢測器，在確保另外一臺設備完好的情況下將流通池進行調換，調換後發現，原先有故障的設備恢復了正常，相反，原來正常的設備基線噪音變大，從而表明流通池出了問題。對流通池進行清洗，清洗之後基線恢復了正常（操作指南上有流通池的清洗步驟）。
2.6 流動相對基線的影響
高效液相色譜儀在測定之前通常需要對流動相進行切換，尤其用到緩衝鹽時需要用高比例的水相先進行過渡，然後再用流動相平衡色譜柱，如果測定時操之過急，色譜柱未完全平衡就進行測定容易出現基線不同程度的漂移。下圖是有機酸測定時色譜柱平衡的基線圖，由於流動相用到了磷酸二氫鈉（磷酸調pH值3.0），而且在較低的波長下進行測定（218nm），因此在色譜柱平衡階段出現了基線向下漂移的情況，經過一段時間的平衡，基線下降趨勢減緩並逐漸走平。
流動相對基線噪音的影響因素很多，例如氣泡、汙染物、添加劑、緩衝鹽等，都可能導致基線噪音增大或者基線的漂移。
2.7 反壓（又叫背壓）對基線的影響
高效液相色譜儀的系統壓力較高，色譜柱是產生系統壓力的主要部件，流動相流過色譜柱和檢測器之後壓力迅速下降會使流通池中產生氣泡，從而影響基線。反壓抑制器能夠減緩流動相流出流通池時的壓力下降程度，防止流通池中產生氣泡。有些儀器是在檢測器後面加上一段比較細的管路，還有些儀器是在檢測器後面加上一個反壓抑制器，通過較細的管路或者反壓抑制器對檢測器形成一定的反壓。不合適的反壓也會對儀器或者基線產生一定的影響，反壓太高超過流通池的耐受壓力，會導致流通池的損壞；反壓不夠流通池中容易產生氣泡，影響基線，例如下面這個案例。
下圖是VARIAN LC 240液相色譜儀平衡色譜柱時的基線圖，從圖中可以看出，每隔10min左右基線就會產生一個波動信號，而且非常有規律，排查原因發現，原來是將伸入廢液瓶的反壓抑制器弄掉了，重新安裝後基線恢復正常。
本文從實際案例出發，介紹了液相色譜分析中常見的幾種基線問題及相應的解決方法，然而影響液相色譜基線問題的原因還有很多，除了上述提到的因素外，溫度、檢測波長、漏液、色譜柱、電壓等原因也可能引起基線有異常，如果在日常分析中遇到基線問題，可以先對上述幾種原因進行逐一排查。
另外，希望本帖是拋磚引玉之貼，各位老師可以將平時分析過程中遇到的一些異常情況及解決過程記錄下來，一起分享，今天您解決的問題或許就會成為我明天的困惑。
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