Western Blot 實驗原理及相關試劑詳解

2021-02-08 拜爾迪生物

Western Blot 實驗原理：蛋白質印跡法（免疫印跡試驗）即Western Blot，也稱Western、Western blotting、Western印跡，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一。它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。

與 Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot採用的是聚丙烯醯胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，「探針」是抗體，「顯色」用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝 酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗 體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用於檢測蛋 白水平的表達。

Western Blot 實驗步驟：樣品製備、上樣與電泳、轉膜、封閉、抗體孵育和檢測


Western Blot 實驗試劑：

   樣品製備   


   蛋白定量   

應用: WB;Dot;ELISA 推薦稀釋濃度: 1:500-1:5000
同種型：小鼠lgG 特異性：適用所有物種
Bradford 法是最簡單和快速的比色蛋白定量方法，Bradford 方法進行了改良，最大限度的加大蛋白定量的線性範圍，變異性小於普通考馬斯亮藍染色法，靈敏度範圍為 100～1500 µg/mL。
BCA蛋白定量試劑盒,45分鐘內可完成測定，蛋白質測定範圍是20～2000 µg/mL。

註：用RIPA裂解液裂解得到的蛋白樣品，可以用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度；由於含有較高濃度的去垢劑，不能用Bradford法測定由RIPA裂解液裂解得到樣品的蛋白濃度。


   孵育盒    


   凝膠溶液   


   電泳及上樣緩衝液    


   蛋白Marker   


   染色液    


   轉膜緩衝液   


   轉印膜   


   酶標二抗    

二抗建議稀釋範圍:
免疫組化/免疫化學：1:500 - 1:5,000
ELISA 和 WB(顯色底物)：1:5,000 - 1:100,000
WB(ECL化學發光底物)：1:10,000 - 1:200,000
防腐劑：無添加 (疊氮化鈉作為防腐劑的使用將大大抑制辣根過氧化物酶的酶活性)。


   封閉    


   內參及標籤抗體    

應用: WB;Dot;ELISA 推薦稀釋濃度: 1:500-1:5000
同種型：小鼠lgG 特異性：適用所有物種


   顯色試劑    

拜爾迪超敏化學發光液是一種基於魯米諾的超靈敏、極低背景的化學發光檢測底物溶液。通過加入促進化學發光信號的複合增強劑，對蛋白印跡實驗中辣根過氧化物酶的檢測具有極高靈敏度，可以檢測到≤0.05ng/ml 濃度的 HRP。


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