1.親和層析技術的原理
親和層析是應用生物高分子與配基可逆結合的原理，將配基通過共價鍵牢固結合於載體上而製得的層析系統。這種可逆結合的作用主要是靠生物高分子對它的配基的空間結構的識別。常用的生物親和關係有酶-底物、底物類似物、抑制劑、激活劑、輔因子，抗體-抗原，激素-受體蛋白、載體蛋白，外源凝集素-多糖、糖蛋白、細胞表面受體，核酸-互補核苷酸序列、組蛋白、核酸結合蛋白等，具有高效、簡單、快速的優點，是當前最為理想的分離純化蛋白的方法。
2.親和層析的常用標籤
標籤純化用的填料或配基洗脫方法多聚組氨酸（His）鰲合鎳、銅、鈷離子的填料咪唑或降低pH穀胱甘肽硫轉酶（GST）鍵合穀胱甘肽的親和填料10-20mM還原穀胱甘肽麥芽糖結合蛋白（MBP）澱粉瓊脂糖凝膠麥芽糖金黃色葡萄球菌蛋白AIgG瓊脂糖凝膠低pHFlaganti-Flag低pH多聚苯丙氨酸（Poly-Phe）苯基瓊脂糖凝膠乙二醇鈣調蛋白結合肽鈣調蛋白EGTA纖維素結合域纖維素鹽酸胍或脲幾丁質結合域幾丁質巰基乙醇，半胱氨酸3.親和層析的純化介質及其作用原理
3.1 his標籤蛋白純化
his標籤常用的純化填料有3種：Ni-IDA Purose 6 Fast Flow最大的優點是載量高，動態載量可達40-50mg/mL，價格也非常實惠；當然缺點也明顯，Ni離子會有一定程度的洩露，純化後的蛋白純度也不算太高；
Ni-NTA Purose 6 Fast Flow不僅純化純度較高，通過控制合理的Ni離子密度，動態載量也達到了IDA的水平，動態載量仍然達到40-50mg/mL，Ni離子更加的穩定；
Ni-TED Purose 6 Fast Flow是一款應時代需要而開發的新生代產品，主要是解決EDTA和DTT耐受問題。強力的螯合配基TED與Ni離子形成5個螯合位點，這與EDTA與Ni的螯合類似（EDTA儘管有6個螯合位，但一般與Ni的螯合也是5個位點），因此Ni離子異常穩定，其螯合後的顏色也變成了更深的藍色。(詳詢電話/微信:劉楊18696113991）
這款產品可以耐受10 mM EDTA和 5 mM DTT 長達24h，或者耐受100 mM EDTA 1h，並且不需要去Ni就可以直接用氫氧化鈉洗去雜蛋白，很適合於樣品液中需要添加EDTA和DTT來穩定蛋白的體系，動態載量可達10-20mg/mL。因為與His6 配位鍵的減少，該載量相比於IDA和NTA相應低一些，但已屬很高水平。(非常適合原核表達體系中有還原劑或者DTT，酵母表達、CHO細胞表達、昆蟲杆狀病毒表達體系的蛋白純化）
3.2 GST標籤蛋白純化
使用千純生物GSH Purose 4 Fast Flow介質純化GST標籤融合蛋白,其穀胱甘肽轉移酶與穀胱甘肽有親和作用蛋白的分離介質，一步分離就可得到高純度的GST融合目標蛋白，純化條件溫和，可以保證蛋白的活性。
3.3 MBP標籤蛋白純化
作為融合蛋白的標籤，通常放在 N 端在大腸桿菌中進行表達。MBP 能促進融合蛋白的可溶性表達，尤其對於難表達的真核細胞蛋白，膜蛋白病毒蛋白有很好的促溶表達能力，MBP 融合蛋白的純化在生理條件下進行， 使用麥芽糖進行溫和洗脫。保護了MBP 標籤蛋白的活性。標籤在純化後期需要用酶切去除， 常用的內切酶是 Factor Xa，麥芽糖酶和腸激酶。
3.4 IgG純化
iProtein A Purose 4 Fast Flow和iProtein G Purose 4 Fast Flow是常用的IgG的純化填料，通過一步純化就可以得到95%左右純度的IgG;填料偶聯的配基蛋白經過了修飾改造，保留了與IgG高結合域，去掉了非主要結合域，降低的非特異性吸附
3.5FLAG標籤蛋白純化
FLAG標籤是由8個胺基酸（DYKDDDDK）組成的一個短肽，分子量很小，因而不會遮蓋融合蛋白中其他的蛋白表位與結構域，也不會改變融合蛋白的功能、分泌或運輸。該標籤具有天然的親水特性，很容易定位於融合蛋白的表面，便於利用抗體檢測；同時含有一個腸激酶切割位點（DDDK），可以利用腸激酶切除標籤。可以通過偶聯了anti-FLAG單抗的介質純化，成本高，不適用於大規模純化
4.常用於穩定蛋白的添加劑
類型功能常用試劑還原劑防止氧化β-巰基乙醇DTTTris(2-carboxyethyl) phosphine(TCEP)蛋白酶抑制劑防止內源性蛋白酶分解蛋白亮抑肽酶（絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制劑）抑胃肽（天冬氨酸蛋白酶抑制劑）PMSF（絲氨酸蛋白酶抑制劑）金屬鰲合劑是金屬蛋白酶失活EDTA、EGTA精氨酸激酶穩定蛋白質結構，增強溶解性丙三醇去汙劑（如CHAPS、NP-40、Triton X-100）糖（如葡萄糖、蔗糖等）離子穩定劑增強溶解性鹽類如Nacl、kCI、（NH4））5.親和純化蛋白的注意點
5.1 Ni柱進行蛋白純化時注意點：
(1)避免緩衝液中有高濃度的電子供體基團，比如：NH4，甘氨酸，精氨酸，等等；
(2)各種緩衝液中不能有強螯合劑，如EDTA，EGTA和濃度的強還原劑，比如DTT等；（可以使用千純生物Ni-TED Purose 6 Fast Flow）
(4) 不能含離子型的去垢劑，比如SDS，防止Ni流失；
(5)在破碎細胞的時候建議加入蛋白酶抑制劑，比如0.1-1mM的PMSF，防止目的蛋白被降解；
(6)緩衝液裡可以加入甘油，防止蛋白之間由於疏水相互作用而發生聚集沉澱，甘油濃度最高可達50%（v/v）
(7)應避免含碳酸氫鈉，檸檬酸等物質；
(8)緩衝液裡NaCl的濃度應在300mM到2M之間；
(9)可加入變性劑促溶，鹽酸胍（最高可6M），尿素（最高可8M）
(10)可加入非離子型去垢劑，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以減少背景蛋白汙染和去除核酸汙染；
5.2. GST柱進行蛋白純化時注意點
(1)在細胞裂解時，加入終濃度1–10 mM DTT可以顯著提高GST融合蛋白的結合效率， 在Binding Buffer和Elution Buffer中加入1–10 mM DTT，可以提高蛋白純度，但是會導致其產率降低
(2)超聲太劇烈或時間過長會引起蛋白變性，導致蛋白不與介質結合。
(3)在pH值低於6.5或高於8.0結合效率會降低，使用前需用pH6.5～8.0的Buffer如PBS進行平衡；
(4)增大Elution Buffer的pH值。Elution Buffer的pH值調至pH 8–9可以提高洗脫效率而不需要增加glutathione的濃度；
(5)增加Elution Buffer的離子強度。加入0.1–0.2 M NaCl能提高洗脫效率；
(6)Elution Buffer中加入非離子型變性劑。非特異性的疏水作用可能會阻礙GST融合蛋白從介質上增溶和洗脫。加入0.1% Triton X-100 or 2% N-octylglucoside可以顯著增加洗脫效率
5.3IgG純化時注意點
(1)介質的選擇Protein A還是Protein G需要根據IgG的來源和亞型確定
(2)在低pH值洗脫後，快速中和,避免抗體長期處於低PH環境中。
(3)長時間保存加入0.02-0.05％疊氮鈉；
(4)加入10%甘油，可有效防止疏水作用引起的聚集。
(5)抗體純度不夠，雜蛋白含量高，易引起蛋白的沉澱。
6.裝柱技巧和純化
(1)用去離子水衝洗層析柱底篩板與接頭，確保柱底篩板上無氣泡，關閉柱底出口，並在柱底部留出1-2 cm的去離子水。
(2)將樹脂懸浮，小心地將漿液連續地倒入層析柱中。用玻璃棒沿著柱壁倒入漿液可減少氣泡的產生。
(3)如果使用儲液器，應立即在層析柱和儲液器中加滿水，將進樣分配器放置於漿液表面，連接至泵上，避免在分配器或進樣管中產生氣泡。
(4)打開層析柱底部出口，開啟泵，使其在設定的流速下進行。最初應讓緩衝液緩慢流過層析柱，然後緩慢增加至最終流速，這樣可避免液壓對所形成柱床的衝擊，也可以避免柱床形成的不均勻。如達不到推薦的壓力或流速，可以用所用泵的最大流速，這樣也可以達到一個較好的裝填效果。當柱床高度穩定後，在最後的裝柱流速下至少再上3倍柱體積的去離子水。標上柱床高度。註：在隨後的色譜程序中，不要超過最大裝柱流速的75%。
(5)關閉泵，關閉層析柱出口。
(6)如使用裝柱器，去除裝柱器，將適配器置於層析柱中。
(7)將適配器推向柱子至標記的柱床高度處。允許裝柱液進入分配器，鎖緊適配器接頭。
(8)將裝填好的層析柱連接至泵或色譜系統中，開始平衡。
(9)3-5倍柱體積去離子水衝洗純化柱。
(10)至少5倍柱體積的Lysis Buffer 平衡層析柱。1ml規格預裝柱推薦流速為1 mL/min，5 mL預裝柱推薦流速為5 mL/min。
(11)利用泵或注射器上樣，1ml規格預裝柱推薦流速為0.2 mL/min，5 mL預裝柱推薦流速為1 mL/min，收集流出液，以便SDS-PAGE檢測蛋白。
(12)Wash Buffer 衝洗柱子，直到紫外吸收達到穩定的基線（一般至少10-10個柱體積）。
(13)Elution Buffer一步法或梯度法進行洗脫。一步法洗脫中一般5倍柱體積洗脫液。梯度洗脫可以用一個小的梯度，例如10倍柱體積或更多來分離不同結合強度的蛋白質。
(14)依次用3倍柱體積的Lysis Buffer和5倍柱體積的去離子水清洗層析柱。5倍柱體積的20%乙醇平衡層析柱，最後將填料保存在20%乙醇中，置於4℃保存。