對於"大蛇丸到底是男是女這個問題"，曾經引起不小的討論。有的火影愛好者認為大蛇丸是男的。持這種觀點的火影愛好者就會把大蛇丸尊稱為"蛇叔"。而有的火影愛好者認為大蛇丸是女的。持這種觀點的火影愛好者就會把大蛇丸尊稱為"蛇姨"。
特別是當巳月問大蛇丸，"你到底是我的爸爸呢，還是我的媽媽呢？"我們才從大蛇丸的口中得知了大蛇丸的"真實"性別。大蛇丸說到，他有時候是男的，而有時候是女的，還有的時候不男不女，是不存在與這個世界上的生物。
大蛇丸話語一出，立即引起了不小的轟動！大蛇丸究竟屬於什麼樣的東西？時而男時而女，時而是一種未知的、不存在的奇怪生命體？他到底是一個什麼樣的存在？對於大蛇丸來說，自己外在的性別並不重要，重要的是自己對萬事萬物至真之理的追求之心。
不得不說，大蛇丸在《火影忍者》故事中還真是非常特別的存在。所以，對於"大蛇丸到底是男的還是女的"這個問題，似乎並沒有太多要爭論的。我們只需要知道，大蛇丸就是大蛇丸，他是一個只對研究忍術，以及探究無上真理的科學怪人、思想家、醫藥學家等大家就行了。
其實，大蛇丸原本設定的性別是男的，不論是從生理性別還是從靈魂性別上來說都是這樣的。這一點，在《火影忍者》故事劇情中早就已經透露出來了。只是由於大蛇丸懂得不屍轉生之術，如果自己轉生到女的身體裡（女的身體作為新的容器），大蛇丸就變成的女的。
所以才有一個上述"大蛇丸到底是男的還是女的"這樣的疑問，以及由於這個疑問產生的一系列討論。在《火影忍者》故事中，自來也曾經帶著鳴人和小櫻到田之國秘密調查音隱村的有關情報。
我們知道，音隱村位于田之國，而音隱村的建立者正是大蛇丸。在調查中，自來也曾經遇到過一批風魔一族的忍者。通過風魔一族的頭頭，我們知道，他確確實實把大蛇丸當成男的。田之國的忍者原本相互分工協作，彼此之間一團和睦，"直到那個男人到來……"
這裡所說的"那個男人"正是大蛇丸。所以，毫無疑問的是，在大傢伙看來大蛇丸確實是個男的。大蛇丸的到來，破壞了田之國忍者之間的平衡，還建立了自己的武裝力量——音隱村。所以大蛇丸這個男人普遍被這一部分忍者所痛恨……
綜上，大蛇丸在《火影忍者》故事中原本的設定就是男的，只是因為大蛇丸會轉生之術，可以不斷地轉生到其他生命體的身上去，所以才具有了不同的性別。大蛇丸並不在乎自己的性別，而只在乎自己對於研究的意志。