隨著新冠疫情的持續，目前全國各大中小型醫院大多已具備核酸檢測能力。核酸檢測作為新冠確診的金標準，卻具有奇高的假陰性率，對於「假陰性」這裡不做過多闡述。那麼目前面對大批量樣本的臨床檢測，作為核酸檢測人員，你能確定你做出的「陽性」就一定不是「假陽性」嗎?
2020年7月2號，我院第一次正式開展新型冠狀病毒核酸檢測工作。在此之前本科室先後抽調3名工作人員前往其他單位協助進行核酸檢測工作，工作流程及操作方面已準備充分。我很榮幸參與到這項工作中，成為科室的「先頭兵」。收集樣本、核對名單、樣本編號、試劑配製、實驗操作、上機擴增、實驗室消毒，一切按照我所預期的劇本進行著，期待著所有樣本呈陰性，然後發報告、順利下班。
可當結果出來以後，卻發現我拿的劇本好像出了點問題，「小插曲」出現了。見下圖：
第一批次20號樣本
—閾值，—FAM通道，—VIC通道，—ROX通道
圖1
FAM通道ct值為14.98，代表新冠ORF-1ab基因
VIC通道ct值為17.04，代表新冠N基因
ROX通道ct值為28.05，代表管家基因
我們採用的試劑為上海伯傑新冠核酸檢測試劑，其說明書給出的陽性參考值為ct≤38。
僅從ct值方面判斷，該樣本新型冠狀病毒核酸檢測為陽性。
圖2 圖3
陰陽性對照曲線見下圖：
圖4 陽性對照
圖5 陰性對照
陰陽性對照結果無異常，那麼20號樣本新冠核酸檢測結果是「真陽性」嗎？
本批次共檢測90個樣本，除20號樣本外，還有其他7個樣本的曲線也出現尾部抬高現象，如1號和4號樣本，見下圖：
圖6 1號樣本 圖7 4號樣本
其他樣本曲線正常，如6號樣本，見下圖：
圖8 6號樣本
這8個樣本為何會出現這種異常曲線？這些樣本的檢測結果是「真陽性」還是「假陽性」？有沒有可能是儀器出現故障？或是操作過程被陽性對照汙染？一連串問號在我腦子裡瘋狂快速地打著轉。帶著這些疑問，我查看了各樣本的原始曲線（上圖中的曲線是經過處理的相對曲線）
1、 正常樣本的原始曲線圖
圖8
從上圖8可見，FAM通道和VIC通道基本為一條直線，ROX通道基線期、指數增長期和平臺期分隔明顯，符合標準的S型曲線。
2、異常樣本原始曲線圖
圖9 20號樣本 圖10 1號樣本
這兩個樣本的曲線有個共同點，它們的FAM和VIC通道曲線不符合標準S型曲線，基線期、指數增長期、平臺期無明顯分隔。其它異常樣本曲線同上。從這個曲線圖來看，我開始懷疑這些異常樣本ct值的真實性了。於是把所有異常樣本找出，和第二批樣本一起進行複查。
複查結果出來了，可結果卻讓我更加疑惑了。
複查的20號樣本結果變為標準陰性，可第二批樣本中出現了更多和之前一樣的異常曲線，總共檢測96個樣本，出現了12個異常曲線，曲線特點和第一批一樣，如下圖：
圖11 第二批12號相對曲線 圖12 第二批12號原始曲線
圖13 第二批16號相對曲線 圖14 第二批16號原始曲線
出現第二次異常曲線後，我靜下心來整理思緒，開始分析原因：
1、 試劑配製過程
試劑配製完全按照操作流程規範操作，無原則性錯誤。
2、 核酸提取過程
樣本經56℃滅火30min後進行核酸提取，吸樣操作規範，核酸提取在全自動核酸提取儀中進行，減少了人為操作誤差。
3、 擴增儀存在故障？
擴增儀在正式投入使用之前做了兩次測試及性能驗證，但考慮到並沒有測試所有孔位，馬上懷疑是否個別孔位溫控系統或者讀取螢光系統存在缺陷。當即對照了第一批和第二批出現異常曲線的孔位，第一批次8個異常樣本，第二批次12個異常樣本，且兩個批次的異常樣本重複孔位少見。導致突然燃起的一絲曙光又破滅了。
實在找不出問題所在，只得打電話求助儀器工程師。工程師懷疑最後上機的反應管中存在氣泡導致螢光讀取受到幹擾。由於在上機擴增前我們已經對反應管離心處理，所以對這個解釋我是抱有一絲懷疑的態度的。
雖然有點懷疑，但還是不自主的拿出儀器中擴增完成的反應管看了一下，也許經過高溫擴增以後還能看到幾個大氣泡也說不定。事實證明，我的第六感「懷疑」沒錯，氣泡倒是沒有看到，但我看到了真相。
圖15 擴增完成的反應管
圖15中所標示的1、2分別是兩個異常曲線樣本，仔細看可以發現，這兩反應管中的反應液面要低於其他管，每個反應管中加入的總體積應該是25ul，可它倆的液體量為什麼會少些？遂查看其他異常樣本，發現每個異常樣本反應液都或多或少的減少了，而且減少的液體量越多，ct值越小。
真相似乎離我越來越近了，回過頭再查看我們使用的八連管，卻發現一個令人哭笑不得的問題：這兩批樣本使用的八連管與八連管蓋不是同一廠家產品。我瞬間頓悟，由於實驗室有其他項目採用的不同廠家試劑，而且都會配送八連管，從外型看兩者沒多大區別，我們在操作時使用了不同廠家的管與蓋，導致個別孔位管與蓋不密封，擴增途中經高溫使液體蒸發。
從工程師處得知，該實時螢光定量PCR儀從樣本頂部讀取螢光值，難道是因為這些反應管不密封導致管中反應液蒸發出來，幹擾頂部螢光讀取?查閱資料，發現並沒有相關報導，無從考證。
對之前的粗心大意予以糾正後進行第三次檢測，結果如我所願，不再出現之前的異常曲線，所有複查樣本均為陰性。如下圖
圖16 複查樣本
在之後的檢測中，類似情況再未出現，可確定本次檢測為使用不配套的八連管與蓋導致的假陽性結果，而其導致假陽性的具體原理還有待進一步探討。
造成PCR假陽性問題的因素相對單一, 由於PCR的敏感性和效率特別高, 只要有少的擴增產物將標本或反應管汙染即可出現假陽性, PCR儀器的性能差異和溫控不準等質量問題造成非特異性擴增也會導致假陽性現象。如果樣本採集和PCR試劑配製及反應實驗過程中, 引物設計不合理, 選擇的擴增列序與非目的性擴增列序具有同源性, 檢測樣品出現交叉汙染、PCR試劑汙染或PCR擴增產物汙染、氣溶膠汙染以及實驗室中克隆質粒汙染都會造成假陽性現象出現。[1]
除此之外在整個實驗的操作過程中必須嚴格按照SOP執行，避免出現像我們一樣的低級錯誤而導致實驗結果假陽性。
參考文獻
[1]鄭甲蘭.PCR檢測中的假陽性和假陰性問題分析[J].中國醫藥指南,2012,10(22):390-391.
編輯 想當攝影師的檢驗師
審核 壹加壹小綿羊 武漢胖紙醫僧
作者丨劉強
單位丨懷化市腫瘤醫院