shRNA原理及設計
RNAi概述：RNA幹擾（RNA interference, RNAi）是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。簡單的說是指一種分子生物學上由雙鏈RNA誘發的基因沉默現象。當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA時，該mRNA發生降解而導致基因表達沉默，是一種特異性的轉錄後基因沉默(post-transcriptional gene silencing and transgene silencing)。由於RNAi具有高度的序列專一性和有效的幹擾，可以特異地將特定的基因沉默，從而獲得基因功能喪失或基因表達量的降低，因此可以作為功能基因組學的一種強有力的研究工具。RNAi技術可廣泛應用到包括功能學，藥物靶點篩選，細胞信號傳導通路分析，疾病治療等等。
RNAi基本原理示意圖：
RNAi類別：
1、siRNA合成：原理：在RNAi效應階段，siRNA雙鏈結合一個核酶複合物從而形成所謂RNA誘導沉默複合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活的RISC通過鹼基配對定位到同源mRNA轉錄本上，並在距離siRNA3』端12個鹼基的位置切割mRNA。
化學合成的siRNA具有操作簡便、轉染效率高、對細胞的或者組織的毒副作用小、可大規模製備等優點，特別適用於基因靶位點不確定情況下，進行siRNA有效片段的篩選。
2、microRNA幹擾載體構建：原理：載體採用Pol II啟動子表達人工設計的微小RNA (miRNA), 後者從長的轉錄本被加工，進而導致特異性的mRNA的降解。
3、shRNA幹擾載體構建：短髮卡RNA (shRNA) 是可以克隆到表達載體並表達短的幹擾RNA (siRNA, 19-21個核苷酸的RNA 雙鏈)的DNA分子。我們可根據靶標設計短髮卡RNA (shRNA)序列並將其克隆到特定載體上。
4、慢病毒RNAi：原理：慢病毒是逆轉錄病毒的一種，具有逆轉錄病毒的基本結構，但也有不同於逆轉錄病毒的組份和特性，作為基因治療載體發展起來，最近已用於轉基因動物製備。利用慢病毒構建的shRNA/miRNA載體，與化學合成的siRNA和基於瞬時表達載體構建的shRNA相比，一方面可以擴增替代瞬時表達載體使用，另一方面，lentivirus－shRNA/miRNA克隆經過慢病毒包裝系統包裝後，可用於感染依靠傳統轉染試劑難於轉染的細胞系如原代細胞、懸浮細胞和處於非分裂狀態的細胞，並且在感染後可以整合到受感染細胞的基因組，進行長時間的穩定表達。
5、腺病毒RNAi：原理：腺病毒（adenovirus，AV）是一種沒有包膜的線狀雙鏈DNA，它能感染分裂細胞和非分裂細胞，在核內以神經元細胞的形式複製，存在多種AV血清型。到目前為止，構建的絕大多數載體都是基於血清型2和5，通過轉基因的方法取代E1或E3基因，降低病毒的複製能力。這些重組病毒僅在表達高水平E1和E3基因的細胞中複製，因此適合應用於治療的高效控制系統。腺病毒載體能夠高效傳遞和表達基因的能力（尤其是在體外），由於具有宿主範圍廣，對人致病性低；在增殖和非增殖細胞中感染和表達基因；能有效進行增殖，滴度高；與人類基因同源；不整合到染色體中，無插入致突變性。對於難轉染的細胞，如原代或非分裂細胞，採用病毒遞送miRNA/shRNA的方式是非常有效的選擇。
幾個概念的區分：
shRNAs (RNA-Short hairpin RNAs)：即短髮夾RNA，是設計為能夠形成髮夾結構的非編碼小RNA分子，可通過RNA幹擾來抑制基因的表達。Thomas Rosenquist和Greg Hannon小組聯合研究了在哺乳動物種系細胞中shRNAs的轉移導致基因長時間穩定沉默的機制。
microRNA（miRNA，微小RNA）是由內源性髮夾（hairpin）結構轉錄產物衍生而來的一種長為19 nt~25 nt的單鏈RNA。在每種高等動物中，存在200種以上的miRNA，是最大的基因家族之一，約佔基因組的1%。
siRNA：(short/small interfering RNAs)：即小幹擾RNA，是一種短片斷雙鏈RNA分子，能夠以同源互補序列的mRNA為靶目標降解特定的mRNA，這個過程就是RNA幹擾途徑（RNA interference pathway）
miRNA，siRNA，dsRNA和shRNA都是RNA幹擾技術中用到的小分子RNA，其不同之處在miRNA 是單鏈RNA，其餘均為雙鏈RNA；siRNA和dsRNA相似；shRNA需通過載體導入細胞後，然後利用細胞內的酶切機製得到siRNA而最終發揮RNA幹擾作用。
miRNA與shRNA圖示：
shRNA（短髮夾RNA）的設計：
1.克隆到shRNA表達載體中的shRNA包括兩個短反向重複序列，中間由一莖環（loop）序列分隔的，組成髮夾結構，由polⅢ啟動子控制。隨後在連上5-6個T作為RNA聚合酶Ⅲ的轉錄終止子。
2.兩個互補的寡核苷酸兩端須帶有限制性酶切位點。
3.Stratagene發現29個寡核苷酸較之原先推薦的23個寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因。
4.在啟動子下遊的酶切位點下方緊連一個C，使插入片段和啟動子有一定空間間隔以確保轉錄的發生。
5.ShRNA目的序列的第一個鹼基必須是G以確保RNA聚合酶轉錄。如果選擇的目的序列不以G開頭，必須在緊連正義鏈的上遊加一個G。
6.ShRNA插入片段中的莖環應當靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的莖環都被成功的運用過。其中包含一個獨特的限制性酶切位點的莖環利於檢測帶有shRNA插入片段的克隆。在比較了眾多不同長度和序列的莖環，5'TCAAGAG3'序列最為有效。
7.5-6個T必須放置在shRNA插入片段尾部以確保RNA聚合酶III終止轉錄。
8.在正義鏈和反義鏈序列上不能出現連續3個或以上的T。這可能導致shRNA轉錄的提前終止。