近日，福建醫科大學第一附屬醫院歐啟水教授等人於Journal Of Viral Hepatitis雜誌發文，深度論述了B肝病毒標誌物在臨床實踐中的應用問題。小編將對這篇綜述的主要內容做編譯整理，以饗讀者。
B型肝炎病毒（HBV）具有獨特的生命周期（圖1），且易整合到宿主基因組中，這使得研究人員及臨床工作者難以分析慢性B型肝炎的自然病程，預測和評估抗HBV藥物療效以及確定治療終點。目前學界主要研究的B肝病毒標誌物包括：鬆弛環狀DNA（rcDNA）、共價閉合環狀DNA（cccDNA）、HBV RNA、B型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、B型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）、B型肝炎病毒核心相關抗原（HBcrAg）。
圖1 HBV複製周期示意圖（Ou Q， et al. 2020）
註：HBV脫殼進入肝細胞後，釋放rcDNA入細胞核。rcDNA以雙鏈線性DNA（dslDNA）的形式還原為cccDNA或整合到宿主基因組DNA中。cccDNA經轉錄合成病毒RNA。前基因組RNA翻譯合成HBcAg和聚合酶，然後組裝成pgRNA顆粒。pgRNA逆轉錄合成rcDNA。子代rcDNA核循環完成細胞內cccDNA擴增。PreS1和PreS2/S區編碼HBsAg，HBsAg也來自整合的HBV DNA。幹擾素影響cccDNA的表觀遺傳學，下調cccDNA活性，而NAs競爭性地抑制逆轉錄蛋白，阻斷pgRNA逆轉錄合成rcDNA。
cccDNA=共價閉合環狀DNA；ER=內質網；HBc=HBV核心蛋白；MVB=多泡小體；pgRNA=前基因組RNA；Pol=聚合酶；rcDNA=鬆弛環狀DNA；ssDNA=單鏈DNA。
本文將主要論述上述標誌物在預測慢性B型肝炎活動性和監測治療應答中的意義，並在此基礎上提出了一些實驗室診斷中應注意的問題。
01
HBV cccDNA
HBV cccDNA在肝細胞核中呈游離狀態，當肝細胞受損時可能出現在血清中。其是唯一的轉錄模板，指導所有HBV產物的表達並保持B肝病毒的複製。cccDNA的數量和轉錄活性對於評估疾病活動性和治療應答非常重要。在肝細胞核中，由於cccDNA很難被消除，且新的肝細胞可被持續感染，cccDNA池是高度穩定的。在免疫系統不完善且沒有治療藥物的情況下，少量cccDNA可能導致大量肝細胞感染HBV或慢性B型肝炎復發。目前認為，消除或永久沉默cccDNA是慢B肝長期治療的最佳策略。
cccDNA位於受感染肝細胞的細胞核中，肝活檢是觀察其特徵的最佳方式。但這種侵入性操作不易被患者接受，並且組織提取物不能代表整個肝臟。自20世紀90年代以來，有多種方法已被用於檢測HBV cccDNA，如巢式RT-PCR、嵌合引物RT-PCR（chimeric primer RT-PCR）、侵染檢測等。但到目前為止，還未開發出獲得廣泛認可的HBV cccDNA精確定量方法或商業試劑盒。因此，尋找新的血清標誌物來間接反映cccDNA的轉錄活性，探索更有效的cccDNA檢測方法非常重要。
02
HBV RNA
血清HBV RNA是前基因組RNA（pgRNA）釋放至細胞外的產物，大小為3.5kb。HBV RNA是HBV DNA負鏈的逆轉錄模板。
血清HBV DNA和HBV RNA與慢性HBV感染初治患者的cccDNA顯著相關。初治患者血清中HBV RNA約為106拷貝/mL，HBV DNA約為109拷貝/mL。核苷（酸）類似物（NAs）可抑制HBV DNA的逆轉錄，故相較於聚乙二醇幹擾素α（PegIFNα），經NA治療後的患者HBV DNA下降更快。相反，NAs不會阻斷HBV DNA轉錄成HBV RNA，因此，隨著治療的持續HBV RNA/HBV DNA的比例可能會增加。當HBV DNA低於檢測下限時，可能無法評估cccDNA的狀態。在這種情況下，HBV RNA檢測可能更有意義，更有利於抗病毒療效的動態監測。
van B mmel等人提出，全長型和頓挫型HBV RNA水平的下降可預測在NAs治療第12周（AUC分別為0.9和0.9）和第24周（AUC分別為0.8和0.85）時的HBeAg血清轉換。Wang等人證明了NAs停藥時血清HBV RNA陽性與病毒再激活的風險有關。
針對HBV RNA的持續檢測不到，Lu等人提出了「前瞻性臨床治癒」的概念。他們認為，HBV DNA和HBV RNA同時低於檢測限或可作為停止NAs治療的一個指標。
Wang等人報導，在恩替卡韋治療後達到病毒學應答的患者中，血清HBV RNA水平與肝內cccDNA水平無相關性，但血清HBV RNA與肝內HBV RNA及肝內HBV RNA/cccDNA比值相關。HBV RNA來源於cccDNA的轉錄，說明HBV RNA可能反映了cccDNA的轉錄活性。
經PegIFNα治療後HBV RNA的下降幅度明顯大於NAs，而PegIFNα治療後獲得應答的患者其HBV RNA下降幅度明顯大於未應答患者。
Giersch等人曾報導，PegIFNα治療期間血清HBV RNA和肝內cccDNA之間沒有定量關係期間。但van B mmel等人曾證明，HBV RNA的cut-off值＞5.5 log10拷貝/ml可鑑別30%的PegIFNα治療12周時的無應答患者（陰性預測值為90%）。在這種情況下，HBV RNA或可作為預測PegIFNα療效的指標。
cccDNA水平不一定與cccDNA的生物學活性一致，因此，雖然HBV RNA與cccDNA水平無相關性，但HBV RNA仍可能反映了cccDNA的活性。
03
B型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）
HBV編碼大（LHBsAg）、中（MHBsAg）、小（SHBsAg）三種HBsAg蛋白；這些蛋白質構成了病毒的外殼。除了完整的病毒顆粒之外，過量的HBV表面蛋白可以組成非感染性亞病毒顆粒（SVP）（圖2）。
圖2 亞病毒顆粒（subviral particles）、完整病毒顆粒（complete virions）和HBcrAg的成分（Ou Q， et al. 2020）
雖然SVP濃度大小（1013IU/mL）是Dane顆粒（109IU/mL）的1萬倍，但常規檢測尚不能明確HBsAg來自於哪種顆粒。
初治CHB患者的血清HBsAg與肝內cccDNA呈正相關。PegIFNα治療期間，血清HBsAg的動態下降可提示持續的病毒學應答。
然而，在NAs治療期間，血清HBsAg的動態變化不盡相同。大多數接受NAs治療的患者血清HBsAg下降緩慢，有些患者甚至需要治療30多年才能實現HBsAg完全清除。這意味著大多數患者可能需要終生服用NAs藥物才能實現功能性治癒。血清HBsAg與肝內cccDNA的相關性存在爭議，因為NAs並不直接靶向cccDNA，這使得人們無法預測從cccDNA翻譯而來的HBsAg最終是何結局。
影響HBsAg定量預測抗病毒藥物療效準確性的因素主要有：
（1）HBV基因組的DR-1/DR-2區包含S基因及其調控元件，常被整合到宿主基因組中。也就是說，HBsAg不僅來源於cccDNA，還可能源於整合的HBV DNA。HBsAg的雙重來源削弱了肝細胞cccDNA與血清HBsAg的相關性，降低了血清HBsAg監測病毒複製的可靠性。
（2）由於S基因的開放閱讀框與逆轉錄酶（RT）基因完全重疊，因此NAs引起的RT基因突變也會改變S基因。而S基因的頻繁突變會改變HBsAg的抗原特性，影響HBsAg定量的準確性。
（3）當HBsAg以HBsAg-抗HBs複合物的形式存在時，將無法被檢測到。
04
空殼病毒/HBcAg
除了完整的病毒顆粒外，感染HBV病毒的肝細胞還分泌不完整的空殼病毒（Empty virus），即由核衣殼（HBcAg）和包膜（HBsAg）組成的無DNA或無RNA的顆粒。
空殼病毒的產生可以僅由S蛋白誘導，而L蛋白雖不是必需的，但可以促進空殼病毒的分泌，這也可能是空殼病毒（1011IU/mL）遠多於完整病毒（109IU/mL）的原因之一。
L蛋白也位於空殼病毒的包膜內，通過NTCP受體幫助病毒進入肝細胞，調節HBV再感染，或在細胞外中和抗HBs。
空殼病毒的HBcAg和HBsAg或可反映HBV複製和免疫狀態。如前所述，HBsAg來源於cccDNA、整合HBV DNA，而HBcAg僅來源於cccDNA（HBV C基因通常不與宿主基因組整合，不表達HBcAg）。雖然完整病毒也含有HBcAg，但數量上僅為空殼病毒的1%。因此，與HBsAg相比，體現空殼病毒數量的血清HBcAg在評估cccDNA的轉錄活性方面似乎更有優勢。
空殼病毒的分泌似乎不受NAs的影響。在替諾福韋治療後達到長期病毒學應答的患者中，HBV DNA載量下降但HBcAg（空殼病毒）水平並未下降，這表明空殼病毒的分泌與完整病毒的分泌無關。但可在少數HBsAg清除的患者中觀察到空殼病毒的減少，這可能與cccDNA沉默有關。
05
B肝病毒核心相關抗原（HBcrAg）
HBcrAg由HBV PreC/C基因編碼，由HBcAg、HBeAg和22 kDa前核心蛋白（p22cr）組成，共有149個胺基酸序列，HBcrAg的檢測就是基於這一序列進行的。
在130例未經治療的慢B肝患者中發現，HBcrAg可反映cccDNA的轉錄活性，因為HBcrAg與總HBV-DNA、cccDNA和pgRNA密切相關。血清HBV DNA無法檢出時，HBcrAg仍存在，且與cccDNA相關（R=0.42，P＜0.0001）。
HBcrAg＞5.7 log10 U/mL是HBeAg血清學轉換後HBeAg再次表達的獨立預測因子（校正風險比 1.855，P=0.021；95% CI 1.099-3.133）。
在接受PegIFNa治療的HBeAg陽性患者中，血清HBcrAg（cut-off值為log108.0 U/mL）可作為治療12周時病毒學應答的預測因子（NPV 94.4%）。
HBcrAg在預測PegIFNα治療應答方面並不優於HBV DNA和HBsAg，但基線HBcrAg聯合HBsAg可以預測HBeAg陰性患者的HBsAg清除率（HBsAg≥3.4 log10IU/mL + HBcrAg≥3.7 log10U/mL,NPV 90%）。但需要注意的是，PreC區域和核心啟動子的突變可能使HBeAg水平下降甚至清除，我們不知道目前一些研究的受試者隊列中是否包含由基因突變引起的HBeAg陰性患者。因此，HBcrAg與cccDNA的相關性分析可能並不是那麼可靠。
06
小結
下表總結了文中的病毒標誌物在臨床中的評估作用。
表1 病毒標誌物在NAs和IFNα治療中的評估作用，以及影響其定量準確性的因素
醫脈通編譯自：Ou Q ， Guo J ， Zeng Y ， et al. Insights for clinical diagnostic indicators of virus and host in chronic hepatitis B infection[J]. Journal of viral hepatitis， 2020， 27（3）:224.