1. 膠的凝結不好，例如有花紋特別是濃度高的膠在冬天溫度較低的情況下，在分離膠的下部有波浪樣的花紋，凝膠不均勻。解決方法：加大 TEMED 和過硫酸胺的量，使其凝結速度加快。同時洗乾淨玻璃板，防止有殘留的膠乾結在玻璃板上。
2. 膠不凝解決方法：溫度較低時加大 TEMED 和過硫酸胺的量，過硫酸胺必須新鮮配製。如若還是不行重新配製一下緩衝溶液。
3. 膠易碎，例如濃度較高的膠在染色和脫色過程以及掃描過程中破裂。解決方法：首先在上述過程中一定要
動作輕緩，其次在室溫較高的情況下可以適當減少 TEMED 和過硫酸胺的量。
4. 電泳完後膠上有很多長條紋的雜帶解決方法：建議電泳緩衝液不要回收利用。配製膠的溶液一定要純。
通常膠在 30 分鐘到 1 小時內凝。如果凝的太慢，可能是 TEMED，AP 劑量不夠。如果凝的太快，可能是 AP和 TEMED 用量過多，此時膠太硬易裂，電泳時易燒膠。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致；後者是由於在解除制膠的夾子後，板未壓緊而致空氣進入引起的，一般對電泳結果不會有太大的影響。
根據樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原 SDS 處理、非還原 SDS 處理、帶有烷基化作用的還原 SDS處理。
1. 還原 SDS 處理：在上樣 buffer 中加入 SDS 和 DTT（或 Beta 巰基乙醇）後，形成 SDS 與蛋白相結合的分子。
2. 帶有烷基化作用的還原 SDS 處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的保護 SH 基團，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的 DTT，而防止紋理現象的產生。100uL 樣品緩衝液中加入 10uL20%的碘乙酸胺，並在 25℃下保藏 30min。
3. 非還原 SDS 處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用 1%SDS 沸水中煮 3min，未加還原劑，因而蛋白摺疊未被破壞，不可作為測定分子量來使用。在較厚的凝膠中，由於凝膠不均勻冷卻，中間部分凝固不好。
電泳系統溫度偏高。
處理辦法：待其充分凝固再作後續實驗。
6. 條帶兩邊向下中間鼓起的原因（︵）
一般原因是兩板之間的底部間隙氣泡未排除乾淨，或聚合不完全。
處理辦法：可在兩板間加入適量緩衝液，以排除氣泡
9. 電泳的條帶過粗
電泳中條帶很粗是常見的事，主要是濃縮膠的原因。
處理辦法：適當增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的 pH 正確；適當降低電壓。
10. 目的蛋白質條帶模糊
1. 電泳凝膠濃度選擇不當。
2. 低於 10Kd 的小分子蛋白質要用 Tricine 膠。
3. 靠近前沿的電泳帶解析度不佳。根據分子量與凝膠孔徑的關係，選擇適當濃度的凝膠。
4. 蛋白質樣品水解。注意除去蛋白質樣品的內源性的水解酶，不要反覆凍融。
5. 電泳時間過長或過短。溴酚藍達到分離膠的底部即應該關閉電泳電源。
6. 緩衝溶液、SDS 都要新鮮配製。
7. 避免加樣過多，提高解析度。小體積樣品可給出窄帶，加樣體積根據樣品濃度和凝膠厚度靈活掌握。一般上樣體積為 10-15uL（即 2-10ug 蛋白質）。
8. 加熱變性後的蛋白質樣品要放置到室溫即電泳，不要久放，因為蛋白質的二硫鍵在高溫下可能是會斷開，但是暴露於空氣中溫度降低會重新形成二硫鍵，而且可能在過久放置過程中蛋白質可能會再摺疊，更不要扔到冰箱裡保存。
11. 「鬼帶」的出現及處理
「鬼帶」就是在跑構象複雜的蛋白質大分子時，在泳道頂端出現一些未知條帶或在加樣孔底部生成沉澱，這主要是因為還原劑在加熱的過程中被氧化失活，使解離的蛋白質分子重新摺疊和亞基重新締合，由於其分子量通常要 比目標條帶大，所以會生成未知條帶或沉澱。處理辦法：在加熱煮沸後，再添加適量的 DTT 或 Beta 巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量 EDTA 來阻止還原劑的氧化。12. 拖尾現象
主要是樣品溶解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。
處理辦法：加樣前離心；選擇適當的樣品緩衝液，加適量樣品促溶劑；電泳緩衝液時間過長，重新配製；降低凝膠濃度。
13. 紋理現象
主要是樣品不溶性顆粒引起的。
處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。
14. 溴酚藍不能起到指示作用
我們在實驗中有時會出現溴酚藍已跑出板底，但蛋白質卻還未跑下來的現象。
主要原因：緩衝液和分離膠的濃度過高。
處理辦法：更換正確 pH 值的 Buffer；降低分離膠的濃度。
15. 甘氨酸在電極緩衝液中的作用
SDS-PAGE 中樣品液和濃縮膠選 TRIS/HCL 緩衝液，電極液選 TRIS/甘氨酸，電泳開始後，HCL 解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質帶負電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在後面形成低電導區，而電場強度與低電導區成反比，因而產生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成以穩定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。
16. 電泳電壓很高但電流很低
現象：電壓 50v 以上，可電流卻在 5mA 以下。
主要原因：電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：內外槽裝反；外槽液過少等。
處理辦法：正確裝配電泳槽即可。
17. 如何提高 SDS-PAGE 電泳解析度
使聚丙烯醯胺的充分聚合，可以提高凝膠的解析度。
建議做法：待凝膠在室溫凝固後，可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或冰箱放置，前者易導致凝固不充分，後者可導致 SDS 結晶。
18. 電泳時間比正常要長
可能是因為凝膠緩衝系統和電級緩衝系統地 PH 選擇錯誤，即緩衝系統地 PH 和被分離物質的等電點差別太小，或緩衝系統的離子強度太高。
19. 配膠緩衝液系統在電泳中的影響
緩衝液在電泳過程中的主要作用是維持合適的 pH。電泳時正極與負極都會發生電解反應，正極發生的是氧化反應，負極發生的是還原反應，長時間的電泳將使正極變酸，負極變鹼。緩衝液可以維持溶液兩極的 pH 保持基本不變。在濃縮膠中，pH 環境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，泳動效率低；而 CL 離子卻很高，兩者之間形成導 電性較低的區帶，蛋白分子就介於二者之間泳動並聚集到一起，濃縮為一狹窄的區帶。所以，pH 對整個反應體系的影響是至關重要的，實驗中在排除其他因素之後仍不能很好解決問題的情況，應首要考慮該因素
科研小分享（第十六期）
素材整理：陳超凡
編輯排版：王 星
參考資料：德泰生物（SDS-PAGE 電泳的常見問題解析（FAQ））