Tobias Mann 1, Wolfram Gerwat 1, Jan Batzer 1, Kerstin Eggers 1, Cathrin Scherner 1, Horst Wenck 1, Franz Stäb 1, Vincent J Hearing 2, Klaus-Heinrich Röhm 3, Ludger Kolbe 4
1.德國漢堡拜爾斯道夫公司前端創新科技
2.美國維吉尼亞Haymarket，DASS手稿
3.德國馬爾堡菲利普斯大學生理化學研究所
通訊作者：Ludger Kolbe，德國漢堡拜爾斯道夫公司前端創新科技
E-mail: Ludger.Kolbe@Beiersdorf.com.
Mann T, Gerwat W, Batzer J, Eggers K, Scherner C, Wenck H, Stäb F, Hearing VJ, Röhm KH, Kolbe L. Inhibition of Human Tyrosinase Requires Molecular Motifs Distinctively Different from Mushroom Tyrosinase. J Invest Dermatol. 2018 Jul;138(7):1601-1608.
譯者簡介：
許陽，南京醫科大學第一附屬醫院皮膚科主任醫師、副教授、碩士生導師，擅長損美性皮膚病診療及皮膚影像技術的應用。任中國皮膚科醫師協會青年委員、玫瑰痤瘡專業委員會委員、國家遠程醫療與網際網路醫學中心皮膚影像能力建設委員會委員、江蘇省整形美容協會皮膚美容學組副主任委員等職務。2017年獲中國皮膚科醫師協會優秀中青年醫師獎。2019年出版專著《見山-值得探討的皮膚科學問題》。
酪氨酸酶是黑色素合成的限速酶，因而成為抑制色素沉著的主要靶點。目前已發現了很多酪氨酸酶抑制劑，但其中大多數由於以蘑菇酪氨酸酶為靶點而缺乏臨床療效。因此，我們用重組人體酪氨酸酶在含有50,000化合物的資料庫中進行了篩選，並與具有顯著美白活性的成分進行了比較。
對苯二酚及其衍生物熊果苷對人體酪氨酸酶的抑制作用較弱，半最大抑制濃度(IC50)在mmol/L範圍，曲酸的抑制作用也較弱(IC50 > 500 μmol/L)。篩選得出人體酪氨酸酶最有效的抑制劑是間苯二酚-噻唑的衍生物，尤其是肽安密多（異丁基咪唑噻唑間苯二酚，Thiamidol )（德國漢堡拜爾斯道夫公司），其IC50為1.1 μmol/L。而肽安密多對蘑菇酪氨酸酶僅有微弱的抑制作用(IC50 = 108 μmol/L)。
在黑素細胞實驗中，肽安密多可強效且可逆性抑制黑色素生成(IC50 = 0.9 μmol/L)，而對苯二酚則不可逆性抑制黑素生成(IC50 = 16.3 μmol/L)。臨床上，肽安密多在4周內即可顯著減少老年斑的生成，12周後部分老年斑與鄰近的正常皮膚邊界難以區分。未來有待進一步研究探索肽安密多在降低人體皮膚色素沉著方面的全部作用。
黃褐斑、日光性和老年性黑子和炎症後色素沉著是許多患者就醫的主要損美性疾病。一般而言，這些疾病對較深膚色人群的影響範圍更廣而且嚴重程度更高(Stratigos & Katsambas, 2004)。
目前現有許多治療色素增加性疾病的外用產品都含有多種活性成分，可減少黑色素的生成和/或分布。雖然可以通過各種機制減少皮膚色素沉著(Briganti et al., 2003)，但酪氨酸酶作為黑色素合成的限速酶，已成為抑制色素沉著的主要靶點 (Kanteev et al., 2015; Lee et al., 2014; Ramsden & Riley, 2014)。
文獻中已記載了許多含酪氨酸酶抑制劑的成分，但大多數無臨床療效，目前只有少數用於皮膚病的外用製劑中(Chang, 2009; Kim & Uyama, 2005; Rescigno et al., 2002)。其中以曲酸、對苯二酚和熊果苷最為常見(Solano et al., 2006)。
目前使用酪氨酸酶抑制劑的臨床療效並不理想，其原因很大程度上是由於這些化合物僅經雙孢蘑菇(mTyr)中分離的酪氨酸酶測試(Espin et al., 2000; Garcia-Molina et al., 2005)，這是商用的唯一活性酪氨酸酶。但mTyr的催化活性和底物特異性與哺乳動物體內酪氨酸酶具有顯著差異(Hearing et al., 1980)。
目前已明確了幾種酪氨酸酶的三維結構，包括mTyr (Ismaya et al., 2011)和來自鏈黴菌(Matoba et al., 2006)和巨型芽孢桿菌(Sendovski et al.,2011)的兩種細菌酶的結構。相比之下，人體酪氨酸酶(hTyr)的動力學或結構信息很少，這主要是由於自然途徑來源或通過異種表達獲得足夠數量的hTyr非常困難。
已有研究表明，hTyr在多種動物細胞系中均有短暫表達(Olivares et al., 2002; Schweikardt et al., 2007; Tripathi et al., 1992; Wendt,2006)，但由於產量太低，無法詳細描述hTyr的表徵。目前有幾個研究小組研發了更高效的hTyr表達系統(Cordes et al.,2013; Fogal et al., 2015; Lai et al., 2016)，但仍缺乏hTyr的三維結構數據或hTyr抑制劑的動力學數據。
本研究使用重組hTyr結構(Cordes et al., 2013)，對一個龐大的化學成分資料庫進行高通量篩選(HTS)，以識別小分子化合物中能有效抑制hTyr的結構。同時評估了部分已知的美白成分（如對苯二酚、熊果苷、曲酸、杜鵑醇和4-丁基間苯二酚）對hTyr活性的影響，並與HTS篩選的新成分進行比較。
篩選得到的肽安密多(德國漢堡拜爾斯道夫公司)(國際化妝品成分命名為異丁胺基噻唑間苯二酚；國際純化學與應用化學聯盟命名為N-(4-(2,4二羥基苯基噻唑-2-基)異丁基胺)，是一種非常有效的hTyr抑制劑，並通過體內試驗證明它也是作用於人體色素沉著的一種安全有效的抑制劑。
hTyr的抑制劑
從50,000種化合物的成分資料庫中篩選得到了幾種有效的hTyr抑制劑。其中，噻唑基間苯二酚的衍生物是最具前景的一類化合物。隨後對主要化合物進行優化，從而開發出具有高活性且理化性質與外用配方相容的衍生物。
肽安密多 (異丁胺噻唑基間苯二酚，化合物1)(圖1)被證實為最有效的衍生物之一。在多個濃度範圍內(最多4級)測試了肽安密多、 4-丁基間苯二酚(化合物2)和經典的酪氨酸酶抑制劑（曲酸(化合物5)、對苯二酚(化合物6)、熊果苷(化合物7)和杜鵑醇(化合物9)）對 hTyr雙酚酶(左旋多巴氧化酶)的抑制作用。
結果如圖2a和表1所示，在這些活性成分中，肽安密多是迄今為止最為有效的hTyr抑制劑，其半最大抑制濃度(IC50)為1.1 μmol/L，10 μmol/L以上幾乎完全抑制hTyr。間苯二酚衍生物4-丁基間苯二酚、4-己基間苯二酚和4-苯基乙基間苯二酚的IC50值分別為21 μmol/L、94 μmol/L、131 μmol/L(表1)。
當IC50值約為500 μmol/L時，曲酸的功效比肽安密多弱500倍。對苯二酚和熊果苷對hTyr的抑制效果極差，IC50值均在mmol範圍內。在測定濃度範圍內，曲酸、熊果苷和對苯二酚均不能完全抑制hTyr。外旋杜鵑醇作為左旋多巴氧化酶的抑制劑也作用甚微，其IC50 >1200 μmol/L(圖2a)。
肽安密多抑制hTyr的詳細動力學分析中，明確其為一種強競爭性抑制劑，抑制常數(Ki)為0.25μmol/L (圖2 b,表1)。Ki值是符合量效曲線估算所得IC50值(1.1 μmol/L) (cf.圖2)，對於競爭性抑制來說IC50值應該約為Ki值的3倍。
4-丁基間苯二酚、4-己基間苯二酚和4-苯基乙基間苯二酚的Ki值(9 μmol/L、39 μmol/L、24 μmol/L)也顯著高於肽安密多Ki值(表1)。這些數據表明與其他三個間苯二酚衍生物(4-丁基間苯二酚、4-己基間苯二酚和4-苯基乙基間苯二酚) 的碳氫化合物側鏈相比，肽安密多的噻唑醯胺結構具有更好的hTyr抑制作用。
同上所述， mTyr不同於hTyr，4-丁基間苯二酚、4-己基間苯二酚、4-苯基乙基間苯二酚及曲酸比肽安密多抑制mTyr的作用更佳(表1)。因此，使用mTyr就不會篩選出肽安密多，同時4-苯基乙基間苯二酚的功效也被嚴重高估了。
最近Garcia-Jimenez等人(2016)報導了mTyr可緩慢地氧化部分間苯二酚，提示是該酶的主要二甲基形式事先通過添加物（如H2O2和抗壞血酸鹽）轉化為氧或脫氧形式，並由鄰二酚維持反應。
因此，我們使用定量高效液相色譜分析(Ito & Wakamatsu, 2015)來檢測肽安密多是否也可能是hTyr的底物。在正常檢測條件下(無Garcia-Jimenez et al., 2016中提及的添加物)， 在hTyr孵育的數小時內未檢測到肽安密多被氧化，而同樣時間內杜鵑醇已經被氧化(見在線附件圖S1)。因此，我們推測Garcia-Jimenez等人描述的反應與肽安密多和生理狀態的hTyr無關。
圖1：本研究所用抑制劑的化學結構。化合物1，肽安密多（德國漢堡拜爾斯道夫公司）（異丁醯胺噻唑基間苯二酚）; 化合物2，4-丁基間苯二酚；化合物3，4-己基間苯二酚；化合物4，4-苯基乙基間苯二酚；化合物5，曲酸；化合物6，對苯二酚；化合物7，熊果苷；化合物8，二甲氧基甲苯基間苯二酚；化合物9，杜鵑醇.
圖2：肽安密多、4-丁苯二酚、曲酸、杜鵑醇、對苯二酚和熊果苷抑制黑色素生成。(a)使用50 mmol/L磷酸鈉緩衝液溶解的純化hTyr，pH 7.0，底物(左旋多巴)濃度為1 mmol/L，對上述不同濃度的抑制劑進行體外檢測。數據用平均值±三次獨立實驗的標準差。(b)在所記錄的濃度下，肽安密多（德國漢堡拜爾斯道夫公司）抑制hTyr的動力學。實驗在pH 7.0的條件下重複3次。根據Lineweaver-Burk繪製數據。(c)在MelanoDerm (MatTek公司，麻薩諸塞州阿什蘭)皮膚模型中的黑色素抑制作用。在培養13天後在各種抑制劑的濃度下，測定每一個MelanoDerm皮膚模型的黑色素含量。數據代表平均值±五次獨立實驗的標準差。AU,任意單位; hTyr, 人體酪氨酸酶; M, mol/L.隨後用人體皮膚的三維模型測試了這些化合物的潛在抑制作用。發現使用純化的hTyr，熊果苷對MelanoDerm (麻薩諸塞州阿什蘭MatTek公司)皮膚模型(IC50 > 4000 μmol/L)的黑色素生成的抑制作用微不足道(圖2c)。
曲酸對黑色素生成的抑制作用（IC50 > 400 μmol/L）呈陡直的量效曲線，當濃度低於200 μmol/L時對黑色素生成的抑制作用較弱(i.e.,150 μmol/L時抑制5%)。杜鵑醇對黑色素生成的抑制作用也較弱，IC50 >1200 μmol/L時的抑制作用明顯。
對苯二酚IC50為15 μmol/ L時，對MelanoDerm皮膚模型中黑色素的產生抑制作用，表明其可能存在抑制酪氨酸酶以外的作用機制。4-丁基間苯二酚IC50為13.5 μmol/L時可抑制黑色素合成。
此外，肽安密多是迄今為止在MelanoDerm皮膚模型中最有效的黑色素抑制劑，其IC50為0.9 μmol/L。在單層細胞培養中，肽安密多顯著減少了黑色素的生成(圖3a)。
在長時間黑素細胞單層培養中，檢測了對苯二酚和肽安密多的可逆性抑制作用。雖然在2周後1 μmol/L的肽安密多使黑色素的生成降低不到60%，但1 μmol/L對苯二酚使黑色素生成僅降低約85% (圖3b)。
然而，進一步在無活性化合物的培養後，被肽安密多抑制的黑素細胞開始迅速重新生成黑色素，在1周內達到預處理水平。相比之下，在2周培養期內對苯二酚處理的細胞並沒有完全恢復黑色素的生成能力，黑色素的生成仍維持在85%的預處理水平。
(a)在微板培養皿中培養來自非洲捐獻者的黑素細胞2周(左)添加或(右)不添加5 mmol/L 肽安密多（德國漢堡拜爾斯道夫公司）；在亮場模式下進行拍攝。通過虛擬對接研究肽安密多可能與hTyr結合的模型。圖4a顯示了以二甲基形式存在的同源hTyr模型與最低能量構象的肽安密多偶聯的活性位點。左側可見雙銅中心橋接氧分子。與結合抑制劑相鄰的只顯示有胺基酸殘基。(殘基編號中包含信號肽)。
按疏水性比例，從親水性的藍色到疏水性的棕色，著色連接結構的內表面。雖然雙銅中心親水性強，但其以I368、V377和F347側鏈為主形成了一個強疏水的側鏈。如圖所示空間方向上，配體的芳香環的1-羥基與雙銅中心廣泛連接，3-羥基與S380側鏈和M374的羰基形成氫鍵。噻唑啉環位於由胺基酸側鏈形成的非極性疏水性交互結構上(圖4b)，大部分在mTyr和hTyr之間均存在差異(圖4c)。
當肽安密多與最近發現的相似TRP1的X線結構結合時，得到了可比性結果，含Zn2+的黑色素合成酶在人體的功能尚不明確(Ghanem & Fabrice, 2011; Lai et al., 2017)，提示肽安密多也可抑制TYRP1酶(參見在線附錄S2)。
(a) 肽安密多（德國漢堡拜爾斯道夫公司）位於hTyr的同源模型中，如文中詳細說明。底物結合的內表面按疏水性著色：灰色為疏水性；藍色為親水性。(b)穩定模型的酶-配體複合物的相互作用原理圖。疏水相互作用用黃色圓弧表示，氫鍵相互作用用紅色和綠色箭頭表示，π-π鍵用藍色箭頭表示。(c)CuB區hTyr與mTyr同工酶PPO3和PPO4的胺基酸序列比較。銅連接的組氨酸用紅色標記，可能與肽安密多作用的殘基用藍色標記。hTyr,人類酪氨酸酶；mTyr,蘑菇酪氨酸酶。