PHD3缺失促進骨骼肌運動能力和脂肪氧化

編輯 | 孟美瑤

嬰聞之，橘生淮南則為橘，生於淮北則為枳，葉徒相似，其實味不同。所以然者何？水土異也。

我們的身體主要燃燒糖和脂肪，作為細胞動力的主要燃料。大多數細胞都喜歡糖，但是當營養缺乏時（例如在極度勞累或飢餓時），這些細胞就會分解脂肪。了解這種代謝功能背後的機制具有重大科學價值。想燃燒更多脂肪並在運動過程中提高身體機能嗎？可能很快就會有治療方法。哈佛大學的研究人員發現通過消除一種特定的酶，它們能夠增加小鼠的運動耐力和脂肪代謝。在能量（葡萄糖）充足的情況下維持低脂肪酸氧化的機制尚未完全清楚。近期，Yoon等人發現AMPK介導的磷酸化和PHD3介導的羥基化在相反的能量狀態下調節ACC2（關鍵代謝調節因子乙醯輔酶a羧化酶2）。在運動應激下，骨骼肌中PHD3的缺失可以改善線粒體脂肪代謝和肌肉功能。本文揭示了AMPK和PHD3之間的意外關聯，以及PHD3在急性運動耐力和骨骼肌代謝中的作用。

①AMPK介導的ACC2磷酸化降低了PHD3介導的ACC2羥基化②PHD3或AMPK的下調會對脂肪代謝產生相反的影響

乙醯輔酶A羧化酶(ACC) 是複雜的多功能酶系統，可催化乙醯輔酶A的羧化生成丙二醯輔酶A。ACC在脂肪酸代謝中具有重要作用，是控制肥胖和治療代謝症候群的一種有吸引力的治療幹預靶點。

在人類和其他哺乳動物中，ACC酶有兩種亞型：ACC1和ACC2。ACC1和ACC2具有不同的生理功能，ACC1是催化脂肪酸從頭合成的第一步限速反應，其催化三磷酸腺苷依賴性的乙醯輔酶Ａ羧化形成丙二醯輔酶Ａ。丙二醯輔酶Ａ是關鍵的雙功能分子，在細胞質中，由ACC1產生的丙二醯輔酶Ａ在脂肪酸碳鏈延長酶的作用下合成長鏈脂肪酸，然後，長鏈脂肪酸可以合成三醯甘油和磷脂。

相反，ACC2主要在心臟和骨骼肌表達，其丙二醯輔酶A產物是這些組織中脂肪酸氧化（FAO）的有效抑制劑。長鏈醯基輔酶A不能穿過線粒體膜，必須轉化為醯肉鹼轉運到線粒體進行β氧化。催化這種轉化的酶是肉鹼棕櫚基轉移酶I (CPT1)。ACC2調節脂肪酸的氧化，因為它的丙二醯輔酶A產物是CPT1的有效抑制劑。因此，ACC在脂肪酸代謝中起重要作用。在哺乳動物中，ACC1控制脂肪酸的生物合成，而ACC2控制脂肪酸的氧化。

AMPK (AMP-activatedprotein kinase，AMP激活的蛋白激酶)是一種細胞能量傳感器，監測細胞內AMP/ATP，或ADP/ATP的比值。細胞能量應激伴隨著ATP水平的降低和隨後AMP / ATP比值的增加，從而導致AMPK的活化。響應高AMP / ATP，AMPK會磷酸化ACC1和ACC2，從而抑制了它們的酶活性，這一過程是通過阻止了ACC最活躍的寡聚形式的形成來實現抑制ACC活性的。因此，通過磷酸化兩種ACC亞型，AMPK可以協調細胞脂肪合成和分解代謝的速率。

當細胞能量充足時，AMPK不被激活，因此ACC2的活性不被抑制，催化乙醯輔酶A生成丙二醯輔酶A，從而抑制了CPT1並減少了醯基輔酶A進入線粒體內以進行β氧化。最終結果是減少了脂肪酸的氧化，增加了脂肪酸和甘油三酸酯（TG）的合成，但消耗了葡萄糖。因此，ACC2的激活使脂肪酸更多的進入甘油三酯合成途徑，促進脂質合成、抑制脂肪酸氧化。

PHD家族（也稱為EGLN1-3）是一類羥化酶，其屬於氧和α-酮戊二酸依賴性的雙加氧酶家族，響應細胞條件的變化來協調新陳代謝。已經被鑑定的PHD亞型包括:PHD1, PHD2和PHD3。且PHD1-3都是調節HIFs穩定性的氧傳感器。已知PHD通過調節缺氧誘導因子（HIF）的羥基化來調控糖酵解代謝。最近研究表明，PHD也對細胞營養狀況作出應答。PHD3在營養充足條件下會抑制FAO，而PHD3水平低的細胞中無論外部營養條件如何，都具有持續的FAO。

ACC2活性也受到羥基化的調節。研究發現ACC2為脯氨酸羥化酶３（prolylhydroxylase3, PHD3）的底物，而PHD3是一類能夠協調代謝變化的酶，PHD3通過對ACC2的羥基化作用快速觸發對脂肪酸β氧化的抑制作用。ACC2作為PHD3底物。通過激活ACC2，PHD3抑制長鏈脂肪酸的氧化。

 

ACC2羥基化具有能量敏感性，並受到AMPK負調控首先，作者探究在急性營養波動期間PHD3是否影響ACC2羥基化和FAO（脂肪酸氧化）。由於PHD3是一種酮戊二酸依賴的雙加氧酶，而ACC2的激活會抑制FAO，因此推測PHD3可能使ACC2羥基化以響應營養有效性（nutrientavailability，指生存環境中的營養能被直接有效吸收的可能性大小）。此外，雖然PHD3和AMPK信號通路都可能通過不同的翻譯後修飾(PTMs)調控ACC2，但這些PTMs是否協同作用調節ACC2活性尚未被研究(圖1A)。為了研究這個問題，作者進行實驗：首先，為了檢驗PHD3活性是否對營養物質可利用性的波動敏感，在低(5 mM)或高(25 mM)葡萄糖條件下培養的小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)中檢測ACC2羥基化(圖1B)。作者觀察到在低葡萄糖條件下ACC2磷酸化升高(圖1B)，與AMPK在低營養條件下被激活的後果相一致，而 ACC2的羥基化呈相反模式(圖1B和1C)。重要的是，25 mM葡萄糖的添加在5分鐘內引起ACC2的羥基化，但在pan-PHD抑制劑二甲氧基糖苷(DMOG)處理的細胞中沒有引起羥基化(圖1B和1C)。與未處理的對照組相比，DMOG處理在高糖培養基中顯著降低了羥ACC2（即羥基化ACC2）水平(圖1B和1C)。且與高糖相比，胺基酸、脂肪酸或透析血清（透析血清一般用於給細胞創造無外源小分子的培養條件，相較於普通胎牛血清，透析血清中分子量在1萬以下的小分子，如葡萄糖、鹽、胺基酸、激素均被透析去除）的添加對ACC2的羥基化誘導不明顯(圖1D)。這些數據表明ACC2的羥化反應在葡萄糖反應中得到了快速誘導。且根據免疫沉澱的結果顯示，ACC2在高葡萄糖條件中發生羥基化，而ACC2在低葡萄糖條件下發生磷酸化(圖1D和1E)。值得注意的是，AMPK中α亞基的缺失導致ACC2的持續性羥基化，而該羥基化的方式導致ACC2對葡萄糖水平不敏感(圖1F)。在ACC2缺失或低營養條件下，PHD3的表達沒有變化，而在MEFs中，PHD3的缺失並沒有改變ACC2蛋白或mRNA的水平(圖1B)。由於已知PI3K-AKT信號通路與AMPK信號通路協調，文中研究了該通路的調節是否同樣影響ACC2的羥基化。與DMSO對照相比，LY294002(PI3K-AKT抑制劑)或MG132(蛋白酶體抑制劑，可抑制AKT絲氨酸蘇氨酸激酶活性)處理未顯著改變ACC2的羥基化狀態，而AICAR(5-氨基咪唑-4-甲醯胺核糖核苷酸,刺激AMPK持續性激活)處理降低了ACC2的羥基化(用泛羥基抗體評估)（圖1G）。綜上這些細胞數據表明PI3K-AKT不影響ACC2的羥基化，而AMPK介導的ACC2磷酸化會抑制PHD3介導的羥基化。

Fig1. ACC2羥基化具有能量敏感性，並受到AMPK負調控

接下來，作者研究PHD3和ACC2羥基化是否對體內營養利用率(nutrient availability)的變化敏感。為了在體內激活AMPK,將小鼠禁食16小時，在表達PHD3水平最高的組織即心臟和股四頭肌中檢測ACC2的羥化和磷酸化水平(圖2A)發現，雖然禁食後PHD3的表達沒有變化(圖2B)，但相對於餵養的小鼠，禁食小鼠心臟和股四頭肌中ACC2的羥基化顯著降低(圖2C)；相反，兩種組織中磷酸化的ACC2增加，這與之前報導的在低能量條件下AMPK活性升高的情況一致(圖2C)。為了確定體內ACC2羥化是否需要PHD3，作者利用PHD3全身敲除小鼠發現ACC2蛋白水平未發生顯著變化，但股四頭肌ACC2羥基化水平降低(圖2D和2E)，PHD3的缺失並不影響ACC2的磷酸化 (圖2E)。

為了確定AMPK信號是否在體內影響ACC2的羥化作用，作者又測量了AMPKα-KO（催化亞基敲除）小鼠中ACC2的羥化作用。由於AMPK的催化活性喪失，ACC2在AMPKα-KO小鼠體內沒有被磷酸化(圖2F)，表明ACC2是通過AMPK被磷酸化。在AMPKα-KO小鼠股四頭肌中檢測ACC2的羥基化，與體外數據一致的是，與對照組小鼠相比，體內AMPK活性的喪失增加了ACC2羥化信號(圖2F)。這些數據表明ACC2羥化信號在體內依賴於PHD3，對組織的能量狀態敏感，並被AMPK抑制。

Fig2. PHD3介導的小鼠組織中的ACC2羥化作用

由於ACC2與PHD3能夠結合，作者推測這種結合可能對細胞營養狀態敏感。ACC2是一種280 kDa的多結構域酶，由n端(NT)、生物素羧化酶(BC)、羧化轉移酶(CT)和生物素羧化載體蛋白(BCCP)結構域組成(圖3A)。為了確定ACC2被調控（羥基化/磷酸化）的具體位點，作者利用串聯質量標籤(TMT)，通過質譜技術定量分析了ACC2中特定脯氨酸殘基在葡萄糖或PHD3水平變化下的羥化變化，在高葡萄糖中培養的MEFs ACC2免疫沉澱中，發現一些脯氨酸殘基經過質量位移（mass shift）修飾。然而，在葡萄糖或PHD3依賴的情況下，只有P450殘基的質量位移增加了(圖1E)。與高葡萄糖培養基相比，在低葡萄糖培養基中培養的對照組細胞中，P450的質量位移減少了2.3倍。且與對照MEFs相比，PHD3敲除細胞中P450的質量位移減少了5.3倍。這些數據表明ACC2中的P450位點為ACC2響應於PHD3的羥基化位點。而S222為ACC2中被AMPK磷酸化的位點。如圖3A所示，ACC2殘基S222（磷酸化位點）和P450（羥基化位點）分別位於ACC2的NT和BC域，通過結構域建模形成了一個界面鄰近的二聚體，該二聚體S222磷酸化位點相鄰，而P450位點位於二聚體界面的外側(圖3A)。

為了進一步檢測ACC磷酸化是否幹擾了PHD3的結合，文中構建了一系列ACC2突變體,包括WT-ACC2、ACC2-S222A突變體（抑制磷酸化）、ACC2-P450A突變體（抑制羥基化）、ACC2-S222E突變體（模擬持續性磷酸化）。PHD3與ACC2免疫共沉澱實驗證明了在高葡萄糖條件下結合較強，而在低葡萄糖條件下結合很弱，表明了這種結合具有葡萄糖依賴性。為了從分子水平研究這種葡萄糖依賴性，文中通過測量PHD3-HA與WT-ACC2、ACC2-S222A（抑制磷酸化）或ACC2-S222E（模擬持續性磷酸化）在293T細胞中的免疫共沉澱來檢測ACC2磷酸化是否幹擾了PHD3結合。PHD3與ACC2-S222A的免疫共沉澱比其與WT-ACC2的強度更大，這表明抑制ACC2磷酸化會增加ACC2和PHD3之間的結合(圖3C)。WT-ACC2與PHD3免疫共沉澱，在高糖條件下，細胞的羥基化水平升高(圖3D)，相比較而言， ACC2- P450A（抑制羥基化的突變體）的細胞羥基化水平降低(圖3D)。去磷酸化突變體ACC2 -S222A（抑制磷酸化）可以使細胞顯示較高的羥基化水平。所以，PHD3與ACC2的結合具有葡萄糖依賴性，且這些數據暗示該結合與ACC2的磷酸化程度呈現負相關。

因為PHD3利用氧和α-酮戊二酸(alpha-ketoglutarate)羥基化脯氨酸殘基，生成二氧化碳和琥珀酸鹽（succinate），所以文中藉助同位素C14標記的琥珀鹽（丙二醯輔酶A）的含量表徵PHD3的羥基化能力。作者發現，與高葡萄糖培養的WT-293T細胞相比，在低葡萄糖和DMOG處理下[14C]丙二醯-CoA的產量下降，即羥基化程度下降 (圖3E)。且圖3F中同位素結果顯示，在PHD3過表達的293T細胞中， WT-ACC2活性升高，而抑制羥基化的P450A-ACC2突變型活性較低。且與WT-ACC2相比，S222A-ACC2的活性增強(圖3F)。此外，敲低PHD3會降低細胞中ACC2羥基化活性(圖3G)。因此，PHD3影響了ACC2產生[14C]丙二醯CoA，即PHD3影響了ACC2的羥基化活性。

進一步使用質譜測定琥珀酸鹽的產量發現，在WT-ACC2的存在下，觀察到了琥珀酸鹽的生成，而在ACC2-P450A突變體（抑制羥基化）的存在下，沒有觀察到可檢測到的琥珀酸鹽生成(圖3H)。但是在 ACC2-S222A（抑制磷酸化）存在時琥珀酸鹽的顯著生成，而在ACC2-S222E突變體中則相反（模擬持續性磷酸化） (圖3H)。因此，PHD3活性隨著ACC的磷酸化增強而降低。

Fig3. ACC2磷酸化對ACC2羥化和活性的影響

接下來，作者研究了PHD3和ACC2 PTM對脂肪分解代謝的影響。由於長鏈脂肪酸必須通過CPT1轉化為乙醯肉鹼才能通過穿梭途徑進入線粒體進行FAO（脂肪酸氧化），而CPT1被ACC2所抑制 (圖4A)。在MEFs中，與對照相比，在高和低葡萄糖兩種條件下，敲低PHD3後均促進了FAO (圖4B)。因此，PHD3通過ACC2調節FAO。

然後文中探究了檢測ACC2磷酸化是否影響了PHD3調節FAO的能力。文獻報導AMPK介導的ACC2磷酸化能夠激活FAO，因為ACC2磷酸化後會失去對CPT1活性的抑制，從而FAO被激活提高。在高糖環境下，MEFs過表達S222A-ACC2突變的細胞與WT-ACC2細胞相比，FAO水平沒有顯著改變(圖4C)。而過表達P450A突變的MEFs與WT-MEFs相比，FAO水平升高(圖4C)。與WT相比，同時過表達P450A-ACC2和S222A-ACC2的細胞FAO增加了20.7% (圖4C)。並且在PHD3敲低的細胞中，過表達WT-ACC2和S222A-ACC2，FAO均升高(圖4D)。因此，PHD3過表達會抑制脂肪酸氧化(圖4E)。由於AMPK活性抑制ACC羥化作用，於是作者進一步研究在PHD3過表達的情況下，S222E-ACC2的表達是否會恢復脂肪氧化。結果發現在共表達S222E-ACC2和PHD3的細胞中，FAO水平仍然升高(圖4E)。所以磷酸化的ACC2對羥基化有抑制作用，在PHD2過表達時這種羥基化抑制作用也被磷酸化消除了。

接下來作者證明了在體內PHD3驅動的脂質代謝變化，文中使用液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)檢測PHD3KO小鼠股四頭肌中的長鏈醯基肉鹼(圖4G)。與PHD3FL小鼠相比，禁食後PHD3FL小鼠股四頭肌中C12、C14、C16和C18醯基肉鹼含量降低(圖4H)。與餵食PHD3FL小鼠相比，禁食PHD3FL小鼠的肌肉中長鏈醯基肉鹼含量較低(圖4H)。這些長鏈醯基肉鹼在PHD3FL：CMV-Cre小鼠中比PHD3FL小鼠更低，且與營養狀況無關。文中用基質輔助雷射解吸/電離質譜成像(MALDI-MSI)來評估體內代謝物的空間分布(圖4I)。與LC-MS/MS數據一致的是，禁食後PHD3FL肌肉中C14、C16和C18醯基肉鹼水平下降，而PHD3FL：CMV-Cre小鼠的股四頭肌中C14、C16和C18醯肉鹼水平一直處於低水平 (圖4J、4K)。血紅素水平（可以指示組織血管形成和氧合作用）在PHD3FL：CMV-Cre小鼠中保持不變(圖4J)。有趣的是，在細胞實驗中，低葡萄糖條件增加了FAO的水平(圖4B)，而禁食小鼠股四頭肌中C14、C16和C18乙醯肉鹼降低。原因可能是，這些氧化底物在體內禁食期間可能具有較高的氧化率，這將防止醯基肉鹼的積累。PHD3FL：CMV-Cre組織勻漿與PHD3FL組織勻漿相比，兩組在禁食16小時後FAO水平增加 (圖4L)。而PHD3FL：CMV-Cre與PHD3FL小鼠相比，血清游離脂肪酸(FFAs)、甘油三酯(TGs)、葡萄糖、體重或瘦體重沒有顯著差異 (圖5A-5F)。上述結果證明在小鼠體內PHD3會驅動肌肉中的脂質代謝。

Fig4. PHD3的下調導致小鼠肌肉中脂肪酸分解代謝的增加

由於在體外和體內，PHD3的缺失可以激活FAO，並且ACC2和PHD3在氧化型組織（oxidative tissues）中高表達(圖2A)，這暗示著 PHD3功能可能在某些生理條件下很重要。接下來，作者研究了PHD3功能是否與骨骼肌發育和生理相關，文中通過測量I型和II型纖維標誌物MYH7(I型)和MYH2(IIa型)的基因表達來評估PHD3 KO小鼠是否表現出肌纖維類型的改變（5G-5J）。與對照組相比，PHD3FL：CMV-Cre小鼠表現出類似的MYH7表達(圖5G)。對比PHD3FL和PHD3FL：CMV-Cre在餵食和禁食條件下，還觀察到一些MYH2亞型的表達略有變化 (圖5H5J)。由於糖原是儲存能量的主要來源，所以測量了股四頭肌和肝中的糖原水平(圖5K和5L)。與WT小鼠相比，PHD3 KO小鼠股四頭肌糖原水平沒有變化。在肝臟中，餵食的PHD3FL：CMV-Cre小鼠的糖原水平降低，在禁食後，兩組小鼠的糖原水平均降低。上述數據表明了PHD3 KO可以增強能量代謝。PHD3FL：CMV-Cre小鼠在餵食和禁食狀態下的全身能量變化(圖5M、5N)結果顯示，與PHD3FL動物相比，PHD3FL：CMV-Cre小鼠的VO2(耗氧量)和CO2(釋放二氧化碳量)均升高(圖5M)，其體內的RER(呼吸交換速率)無明顯變化(圖5N)。這說明PHD3 KO小鼠的能量代謝可能更旺盛。

Fig5. PHD3FL:CMV-Cre小鼠的表型

 

在運動過程中，肌肉細胞除了氧化碳水化合物外，還會氧化脂肪酸以提供能量需求。前期研究表明，AMPK通過ACC2的磷酸化增加人體能量消耗。ACC2缺失會增加運動能力，而AMPK激活劑（如AICAR）可將運動耐受性提高多達44％，部分原因是通過誘導線粒體基因表達和生物發生。基於AMPK與PHD3之間存在負調控聯繫，作者假設PHD3全身KO小鼠將具有更高的能量消耗和更好的運動能力。文中使用逐漸增加坡度的代謝跑步機分析了對照組和PHD3FL：CMV-Cre小鼠的運動耐力(圖6A)。與同齡對照PHD3FL小鼠相比，PHD3 KO的小鼠跑得時間更長（40%）、距離更遠（50%）(圖6B和6C)。PHD3FL小鼠比PHD3FL：CMV-Cre動物更快達到最大耗氧量 (圖6F)。因此，在劇烈的運動耐力挑戰中，全身PHD3的降低可以提高代謝適應能力和鍛鍊能力。

通過檢測剛分離的PHD3FL和PHD3FL：CMV-Cre小鼠股四頭肌線粒體漿液中[14C]棕櫚酸的氧化率發現：相比運動前，運動後PHD3FL小鼠股四頭肌製備的線粒體勻漿體內FAO含量增加(圖6G)。此外，與PHD3FL組織相比，PHD3FL：CMV-Cre小鼠的股四頭肌表現出更高的FAO(圖6H)。作者測試了鍛鍊後的骨骼肌中ACC2羥化作用是否改變，發現PHD3缺失減少了股四頭肌中ACC2的羥基化(圖2E和6H)。令人驚訝的是，儘管ACC2蛋白水平沒有變化，但在小鼠耐力運動後的骨骼肌中幾乎檢測不到ACC2羥化，這種羥基化依賴於PHD3。因此，運動增加了ACC2的磷酸化，同樣地通過類似的動力學方法在PHD3FL：CMV-Cre動物骨骼肌中誘導了ACC2的磷酸化(圖6H)，進而下調了ACC2的羥基化。

文中通過構建MCK-Cre驅動的特異性敲除肌肉中的PHD3小鼠（PHD3-KO/PHD3FL：MCK-Cre）檢測骨骼肌中PHD3的缺失是否足以增加運動能力。當接受耐力運動時，PHD3FL：MCK-Cre小鼠在跑步機上的運動時間比PHD3FL小鼠更長（23%），跑得更遠（32%）(圖6I和6J)。且PHD3FL：MCK-Cre小鼠和PHD3FL小鼠相比，肌肉特異性敲除PHD3的小鼠在禁食條件下FAO快速增加（圖6K)。這些結果表明，僅在骨骼肌中敲除PHD3就足以提高運動能力。

圖6. 降低PHD3會增加運動能力

這篇文章揭示了PHD3和AMPK對脂肪代謝和運動能力的調控作用。在低營養條件下，AMPK介導的磷酸化抑制PHD3與ACC2的相互作用和羥基化；在能量充足的條件下，AMPK無活性，ACC2沒有磷酸化，PHD3能夠羥基化ACC2(圖6L)。這些數據表明，PHD3的調節可能改善運動刺激的能量穩態和骨骼肌性能，PHD3可能為多種代謝疾病的治療提供一個治療靶點。

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