乳脂肪球膜(MFGM) 蛋白產品功能物質檢測進展

2021-02-22 北京銀河路經貿有限公司

近年來隨著各方對乳脂肪球膜(MFGM)研究的深入,富含脂肪球膜成分的原料越來越受到食品行業,尤其是乳品行業的重視。生產工藝的發展使得一些功能配料實現了產業化,作為乳成分的乳脂肪球膜在工業上主要是以富含乳脂肪球膜的乳清蛋白產品的形式出現。


一個新原料的應用,不僅要有全面的理論基礎支持,還需要有檢測的支持,才能為功能成分的量化和驗證提供切實可靠的依據。美國希爾瑪(Hilmar)配料公司在產品「乳清蛋白粉(富含乳脂肪球膜)型號:Hilmar7500」功能物質檢測方面做了大量工作,同時銀河路也在原料功能成分檢測中尋求與各方檢測機構和科研機構的合作,目前Hilmar7500的很多功能成分已實現了出廠檢驗,並在國內檢測機構進行了產品檢驗驗證。

富含脂肪球膜的乳清蛋白產品中功能成分主要包括,蛋白類、磷脂類、神經節苷脂、唾液酸等四大類,現將這些功能成分的檢測進展匯總如下:富含脂肪球膜的乳清蛋白產品中的蛋白大部分是乳清蛋白成分,除含有主要的乳清蛋白種類α-乳白蛋白、β-乳球蛋白等外,還有一部分蛋白是由於這種產品的工藝特性所決定,在富集脂肪球膜成分的同時,乳清中一些的功能蛋白成分也會被富集,如乳鐵蛋白(Lf)、免疫球蛋白(IgG)、骨橋蛋白(OPN)等。以乳鐵蛋白為例,雖然脂肪球膜上也有微量乳鐵蛋白,但乳鐵蛋白主要分布在乳清中,在富含脂肪球膜的乳清濃縮蛋白產品中,乳鐵蛋白等大分子蛋白也能夠同時被富集。富含脂肪球膜的乳清蛋白產品中的另一類蛋白成分為乳脂肪球膜蛋白。乳脂肪球膜是一種具有3層結構的生物膜,通過蛋白組學等研究和分離鑑定,已在人乳中發現的乳脂肪球膜蛋白質已經接近200種,這些蛋白在脂質和能量的代謝、免疫調節、神經認知、腸菌群和抗癌等多方面發揮著重要的作用。研究發現,牛乳脂肪球膜蛋白的種類超過200種。富含MFGM的乳清蛋白產品中總脂肪球膜蛋白的含量,是脂肪球膜上近200種微量蛋白的總和,是無法直接測定的。而且這些在脂肪球膜上的蛋白存在形式不同,含量差異大,經牛乳或乳清加工成富含脂肪球膜的乳清蛋白粉的過程中經過多個工藝環節,最終產品中保留的不可能是所有脂肪球膜蛋白的絕對量。因而在乳清蛋白粉中,脂肪球膜上含量較高的功能性蛋白成分,如嗜乳脂蛋白(BTN)、乳凝集素((MFG-E8/PAS6/7)、黃嘌呤脫氫酶/氧化酶(XO/XDH)等,是脂肪球膜蛋白含量檢測的一個重點。

蛋白類檢測方法:

LC-MS/MS法

乳脂肪球膜上的功能蛋白的含量相對較低,通過LC-MS/MS方法檢測,篩選蛋白的特異性標籤肽段,相對而言,具有幹擾少、也比較準確的優勢,但相對技術要求也比較高。

美國希爾瑪公司採用LC-MS/MS方法對 Hilmar7500中的乳鐵蛋白、乳凝集素等指標進行批檢

國內檢測研發公司已自行開發建立了成熟的蛋白LC-MS/MS檢測定量技術,可以對上述功能蛋白Lf、IgG 、OPN,以及BTN、XO、乳凝集素等脂肪球膜蛋白,進行原料和終產品中含量的檢測。

一些專業檢測機構 在GBT 5009.194-2003 保健食品中免疫球蛋白IgG的測定方法的基礎上,積極開發出適合乳製品的高效液相色譜檢測法(HPLC-DAD),可檢測乳品原料及乳品製品中IgG含量。

值得一提的是:除乳鐵蛋白已有《食品中乳鐵蛋白的檢測》的國標徵求意見稿中,第一法為肝素親和高效液相色譜檢測和第二法明確闡述了有關總乳鐵蛋白含量的檢測。上述其他功能蛋白檢測暫時沒有國標方法,幾乎所有檢測機構都只是內部檢測方法。

脂類包括磷脂和糖脂,MFGM上的脂質成分主要分為極性脂質和中性脂質,中極性脂質的作用主要為調節脂質代謝、參與神經系統活動等方面,佔MFGM脂質成分的26%~40%,極性脂質包括:

1甘油磷脂:磷脂醯乙醇胺(PE)、磷脂醯膽鹼(PC)、磷脂醯絲氨酸(PS)和磷脂醯肌醇(PI);

2鞘脂:鞘磷脂(SM)。

在MFGM中,PE、PC、SM的含量更為豐富,而PS和PI的含量較少。

中性脂質包括:

甘油三酯、甾醇及甾醇酯(主要為膽固醇)、鞘糖脂(腦苷脂和神經節苷脂)。

乳脂肪球膜產品中備受關注的脂類功能成分包括磷脂即各種極性磷脂,以及神經節苷脂,其中磷脂和神經節苷脂是功能關注熱點。

磷脂類檢測方法:

1. 核磁共振法(31-P NMR),該方法主要特點是快速準確,能夠同時檢測總磷脂和PC、PE、PI、PS以及神經鞘磷脂SM的含量,但受到設備條件的限制,據了解國內採用此法檢測磷脂是一些科研院所具有研究性檢測,也有商業性檢測機構送國外實驗室進行進行核磁法的檢測。該法結果一般是mmol/g,需換算成mg/g,檢測中包括溶血磷脂;

2. 高效液相色譜-蒸發光散射檢測器法(HPLC-ELSD),該方法對檢測儀器相對容易實現,要求具有各種目標磷脂的標品,對樣品處理需保證排除甘油三酯等的幹擾。

3. 液質聯用法LC-MS法, 該方法的特點是檢測靈敏度高,對微量物質檢測有優勢,但由於乳磷脂的脂肪酸組成種類繁多,約有上百種,而神經鞘磷脂也有幾十種,因而在檢測中需要對所有脂肪酸種類進行計算,較為繁瑣,也會因此有一些偏差。

4. 磷脂檢測試劑盒 試劑盒檢測往往是對單一種類的磷脂進行檢測,而脂肪球膜產品的總磷脂和各種磷脂同時檢測不易實現。

美國希爾瑪公司 採用HPLC-ELSD法對Hilmar7500產品中磷脂含量進行批檢

注意

不管是哪一種方法,受乳品原料和乳製品中複雜成分的幹擾,磷脂檢測的樣品前處理是非常重要的。磷脂中PC、PE、PI、PS以及神經鞘磷脂SM分子中除替代基團外,甘油分子連接R1和R2脂肪酸也有多種變化,因而每一種磷脂實際上都是一類化合物的混合物,而不是單一的物質。有時在檢測中需將含多種不同脂肪酸中同類磷脂累計,因而相對繁瑣。此外,不同磷脂標品的來源也是一個關鍵影響因素。
 一些公司提供磷脂檢測試劑盒,需要考慮是否適用於乳基原料的檢測,也有些試劑盒僅針對特定的單一種類的磷脂,如含膽鹼的卵磷脂類檢測等,因而檢測值會偏離產品總磷脂的脂肪球膜產品的實際值。   

神經節苷脂是一類含唾液酸的酸性糖鞘酯,分子上結合有唾液酸。在牛乳中神經節苷脂的含量僅為人乳的1/8,一般牛乳含量為2.5mg/L, 90%以上存在於脂肪球膜上。在富含脂肪球膜的乳清蛋白產品中,神經節苷脂是重要的功能成分。

目前用於神經節苷脂的檢測方法有高效液相色譜法(HPLC-UV)和液質聯用(LC-MS)法。

美國希爾瑪公司採用高效液相色譜法(HPLC-UV)對Hilmar 7500 原料中神經節苷脂含量進行批檢

已有國內檢測研發公司建立了可靠的神經節苷脂的液質聯用LC-MS的檢測方法。


唾液酸(SA)

一般關注的是乳清蛋白產品中總唾液酸含量。

1)唾液酸檢測有燕窩產品的國標方法,GB/T 30636-2014 燕窩及其製品中唾液酸的測定液相色譜法, 該標準的方法檢出限:燕窩為0.3g/kg,燕窩製品為0.003g/kg。但由於乳品原料和乳製品中成分的不同、唾液酸存在形式不同,採用該法的唾液酸檢測值會偏離實際值,一般會遠低於實際含量。一般乳品原料中總唾液酸的檢測由於原料中甘油三酯的含量較高,需要排除甘油三酯幹擾,同時樣品經過前處理使蛋白、磷脂、及神經節苷脂等糖蛋白質和糖脂中結合的唾液酸能夠充分釋放,使總唾液酸含量檢測更接近真實值。2)目前乳品原料和乳製品中SA的檢測多為HPLC方法

離子交換色譜法(HPLC-PAD):國外實驗室檢測採用該方法檢測總唾液酸。總唾液酸包括N-乙醯神經氨酸(N-acetylneuraminic acid,NANA)和N-羥乙醯神經氨酸(N-glycoyineuraminic acid, NGNA或Neu5Gc),定量限分別在10mg/kg和20mg/kg。

唾液酸為糖類衍生物,HPLC-FLD是對糖類衍生物的高靈敏的檢測方法,主要是通過高效的螢光衍生劑進行柱前衍生化,使糖類分子變成帶有發色基團的物質,從而有利於色譜分離及螢光的高靈敏檢測,提高分離程度及檢測靈敏度。國內有檢測機構在保健品燕窩含量(GB/T 30636-2014)基礎上,開發出相對穩定的HPLC-UV 檢測方法。國內有公司開發了高效液相色譜-串聯質譜法(LC-MS同位素內標法),該方法檢測無需處理甘油三酯的幹擾,這種方法應該說對低含量檢測比較敏感,要求樣品稀釋和處理操作的精確性。美國希爾瑪公司採用螢光檢測高效液相色譜法(HPLC-FLD),對Hilmar 7500產品中總唾液酸(NANA)含量進行批檢
總之,乳品原料和乳製品中唾液酸(SA)的檢測還沒有國標方法;上述不同的方法間理論上檢測值相同,但受到檢測器特性、稀釋倍數、檢測經驗性以及前處理等影響,不同檢測方法和實驗室的結果常常存在一定的差異。目前,富含脂肪球膜的乳蛋白產品在國內市場上已有幾款上市,各生產廠家的出廠檢驗報告中一些功能物質都有不同的體現。美國希爾瑪生產的 Hilmar7500 產品批檢報告將陸續體現總乳鐵蛋白、脂肪球膜主要蛋白成分(如乳凝集素等)、總磷脂、神經節苷脂和唾液酸等功能物質的檢測值。

一些國內研究機構、檢測機構和企業也在積極合作開發富含脂肪球膜的乳清蛋白產品中功能成分的檢測方法。由於乳製品和乳品原料成分的複雜性和特殊性,一些其他原料如乳鐵蛋白產品標準、牛初乳產品和燕窩產品原有的標準方法應用中往往出現偏差,開發適於乳品原料、乳製品以及食品的檢測方法是功能原料應用迫在眉睫的工作。希望能在不久的將來MFGM功能成分檢測方法的相關標準能不斷推出,滿足行業需求。

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