信息來源：原創李碧鳳等中國動物檢疫前天
摘要：2019年5月23日，雲南省文山壯族苗族自治州硯山縣維摩鄉散養戶飼養的豬發生疑似非洲豬瘟疫情。文山州動物疫病預防控制中心獸醫分子生物學實驗室運用PCR核酸檢測技術結合臨床剖檢，對該起疫情進行了初步診斷，並經雲南省動物疫病預防控制中心獸醫實驗室覆核，確診為非洲豬瘟病毒感染。此次非洲豬瘟的臨床診斷與PCR檢測，為基層實驗室非洲豬瘟診斷積累了經驗，對非洲豬瘟的早發現、早控制具有積極意義。
非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種急性、烈性、高度接觸性動物傳染病。ASF最早於1921年在肯亞首次報導，並從非洲相繼擴散到歐洲、美洲和亞洲，2018年首次傳入我國，是世界動物衛生組織（OIE）規定的須通報動物疫病，是我國的一類動物疫病。ASF發病率和病死率可高達100%，且因無有效疫苗和藥物治療，其擴散和流行對養豬產業造成了毀滅性打擊，嚴重困擾養豬業的生產與發展，影響著豬肉產品的安全與供給。
基層獸醫實驗室是動物疫病防控的技術保障與根基。目前，基層獸醫診斷技術主要有臨床診斷與實驗室檢測。基層獸醫的臨床診斷技術對非洲豬瘟的早期監測與排查具有重要意義。基層獸醫分子生物學實驗室的有效運轉及PCR檢測技術的充分運用，為基層有效預防、控制和撲滅ASF疫情，維護養豬業健康穩定發展奠定了堅實基礎。2017年9月，文山壯族苗族自治州動物疫病預防控制中心獸醫分子生物學實驗室建成並投入使用，並首先將分子生物學PCR檢測技術應用於禽流感的監測預警。當前可靠性最佳的ASF診斷技術是基於核酸檢測的PCR和定量PCR技術。2019年5月23日，雲南省文山壯族苗族自治州硯山縣維摩鄉散養戶飼養的豬發生疑似ASF疫情。文山壯族苗族自治州動物疫病預防控制中心獸醫分子生物學實驗室運用PCR核酸檢測技術結合臨床剖檢，對該起疫情進行了初步診斷。這是對中心獸醫分子生物學實驗室管理體系、PCR檢測綜合能力的一次考驗與檢驗。總結此次文山州首例ASF病例的緊急檢測工作經驗，可為發揮基層獸醫實驗室在防控ASF等重大動物疫病中的作用提供幫助。
材料與方法
臨床觀察與剖檢
赴現場向養殖戶詢問疫情發生情況、病豬臨床表現。對一飼養戶養殖的2頭白毛家豬，另一戶養殖的2頭黑毛家豬，共4頭病死豬進行剖檢。
PCR檢測
樣品處理。病原樣品：2頭病死豬均為肥豬（黑、白家豬各1頭）。分別採集2頭病豬的脾臟、淋巴結、腎臟、肺臟共8個樣品送檢。病原組織樣品研磨處理：將病原樣品編號，使用高壓滅菌的剪刀和研缽，分別取適當組織樣品剪碎於研缽中，研磨至勻漿狀態，對應編號，保存於2mL滅菌離心管中備用。
樣品DNA提取。將離心管中的組織勻漿樣品，對稱放置於冷凍離心機，4℃ 12000r/min離心5min；每個樣品取200μL上清液至磁珠法病毒DNA提取試劑盒中，按試劑盒要求加入25μL酶，最後放入全自動核酸提取儀中，設置DNA提取程序，啟動全自動核酸提取儀，提取病原樣品DNA；程序運行結束後，將提取的核酸保存於-80℃備用。
PCR體系配置。在滅菌的1.5mL離心管中，製備符合試驗樣本量（包括陽性、陰性對照等）地PCR反應混合物（23μL）。配置步驟：將23μL PCR反應混合液加入到0.2L PCR管中，再將2μL DNA模板加入到PCR管中，另設立陽性、陰性對照；每管加入2μL模板後，密封反應管，瞬時離心；將所有PCR管放在PCR儀中進行擴增。
凝膠電泳及成像。分別取7μL混勻的PCR產物加入到1×TAE緩衝液配製的2%瓊脂糖凝膠中電泳30~40min。電泳結束後，將瓊脂糖凝膠置於凝膠成像系統中觀察結果。
結果
臨床症狀與剖檢
經向養殖戶詢問得知，豬病死前2~3d，有厭食、喜臥、疲憊以及偶有嘔吐等症狀。對4頭病死豬臨床觀察發現，病死豬體表均出現紫色瘀斑（圖1）。剖檢發現，脾臟異常腫大（大5~10倍），顏色發黑，質脆易碎（圖2）；肺臟腫大，腎臟腫脹明顯、色淡，有少量出血點（圖3）；胸腔、心包腔內有積液。
PCR電泳
PCR擴增結果顯示，8個樣本中有7個樣品在257 bp左右有特異性擴增條帶，與陽性對照一致（圖4），4號（肺臟）樣品無特異性擴增條帶。
討論
病死豬體表出現紫色瘀斑，脾臟異常腫大等均符合典型ASF症狀；8個樣本中，有7個PCR檢測出現ASFV的特異性擴增條帶。由此，判斷該病死豬疑似感染ASFV。隨後按有關要求送樣至雲南省級動物疫病預防控制中心經實驗室覆核。截至2019年5月25日疫情發布，相關養殖戶存欄生豬104頭，發病49頭，死亡48頭。疫情發生後，當地已按照要求啟動應急響應機制，採取封鎖、撲殺、無害化處理、消毒等應急處置措施，對全部病死豬和撲殺豬進行無害化處理。同時，禁止所有生豬及其產品出入封鎖區。
本次疫情是文山壯族苗族自治州首例ASF疫情。這次疫情考驗了文山壯族苗族自治州動物疫病預防控制系統的「防控作戰」能力與建設情況，也檢驗了文山少數民族自治區基層獸醫人員的專業技能與基本功。目前，文山壯族苗族自治州動物疫病預防控制中心獸醫分子生物學實驗室配備普通PCR檢測設備，PCR試劑、引物均與雲南省動物疫病預防控制中心要求一致，且檢測技術人員均經過省動物疫病預防控制中心的專業指導與培訓，實驗室已通過全省ASF檢測能力比對。本次樣品的ASFV檢測，從樣品的接收、處理、核酸提取至PCR擴增及電泳結果上報，均有條不絮地按實驗室內部操作程序與質量管理體系進行，是中心獸醫分子生物學實驗室建成以來一次緊急檢測的成功案例。
快速可靠的檢測方法對於及時診斷和預防ASF至關重要。基層獸醫人員將臨床診斷技術與可靠的分子生物PCR檢測技術相結合，提高了基層獸醫對ASF等動物疫病早期診斷、預防與控制的科學性。診斷方法中的實驗室檢測是確診ASF的重要依據。基層獸醫實驗室開展ASF PCR初步檢測，對於加強ASF監測預警，及時發現ASFV感染和疑似感染疫情具有重要意義。此次ASF PCR檢測診斷為硯山縣動物疫控中心做好ASF疫情處置準備工作奠定了基礎，為及時開展ASF防控工作爭取了寶貴時間。PCR檢測技術在基層獸醫實驗室的運用增強了ASF等動物疫病防控工作的主動性和目的性，為科學評估疫情風險提供了技術支持。總結本次ASF PCR檢測工作發現，獸醫分子生物學實驗室的常規PCR檢測存在耗時長、試驗過程產生的汙染物易導致實驗室核酸汙染及實驗室生物安全等問題。建議基層實驗室購置快速、準確的螢光定量PCR儀，以縮短檢測時間，減少汙染，提高檢測結果的準確性。今後，應逐步提高基層獸醫實驗室檢測技術，繼續充實ASF等重大動物疫病檢測、監測的資金投入，完善中心獸醫實驗室的硬體設施，重視「軟體」建設及管理，加強獸醫分子生物學實驗室生物安全防控，充分發揮基層獸醫分子生物學實驗室在動物疫病防控中的作用。