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原文地址：
https://science.sciencemag.org/content/363/6434/1463.full
摘要
細胞在組織中的空間位置強烈影響者它們的功能，然而，目前缺乏可高通量且全基因組範圍內在單細胞水平對基因表達進行準確捕獲的技術。原文作者開發了Slide-seq技術，這是一種將組織切片中的RNA轉移到表面的方法，表面覆蓋有已知位置的DNA條形碼珠，通過測序可以推斷出RNA的位置。使用Slide-seq技術將單細胞轉錄組測序數據鑑定的細胞類型定位在小腦和海馬內，表徵小鼠小腦Purkinje層的基因空間表達模式，並定義創傷性腦損傷小鼠模型中細胞類型特異性反應的時間演變。這些研究強調了Slide-seq如何提供一種可擴展的方法，以單細胞水平的解析度獲得空間解析的基因表達數據。
前言
複雜組織的功能與它們內部的細胞類型組成緊密有關。多重原位雜交和基於測序的方法可以測量基因在亞細胞水平的空間表達情況(1-3 )，但需要專業的知識和設備，以及預先選擇用於測量的基因組。相比之下，利用條形碼寡核苷酸捕獲陣列進行空間編碼核糖核酸測序的技術僅限於幾百微米(4)的解析度，這不足以檢測重要的組織特徵。
結果和討論
為了開發用於高解析度全基因組表達分析的Slide-seq技術，原文作者首先將獨特的DNA條形碼編碼的10毫米微顆粒(「珠」)包裝到橡膠塗層的玻璃蓋玻片上，類似於Drop-seq的單細胞轉錄組測序技術，形成一個我們稱為「圓盤」的單層。他們發現每個珠子不同的條形碼序列可以通過固相化學(寡核苷酸連接和檢測測序)來確定(圖1A) (6-8)。他們接下來開發了一種方案，其中10毫米新鮮冷凍組織切片通過冷凍切片(7)轉移到乾燥的珠粒表面。從組織中釋放的mRNA被捕獲到用於製備3′-末端條形碼核酸序列文庫的珠子(5)(圖1B)。來自小鼠海馬冠狀切片(7)的單個珠子輪廓的聚類產生了反映組織中細胞類型的已知位置的分配(圖1C)。非常精細的空間特徵被分辨出來，包括位於中央心室和小鼠大腦韁核之間的單細胞室管膜細胞層(圖1C)。此外，載玻片序列可應用於一系列組織，包括小腦和嗅球，其中分層組織結構可立即檢測到(圖1D)，以及肝臟和腎臟，其中所識別的簇分別顯示肝細胞分帶模式(9)和腎單位的細胞成分。人體去世後的切片序列也成功地捕捉到了在同源小鼠組織中觀察到的相同結構特徵。通過Slide-seq技術進行的表達測量與來自大量RNA-seq和單細胞轉錄組測序技術scRNA-seq一致，並且每個細胞的平均基因轉錄物捕獲在組織和實驗中是一致的。最後，通過Slide-seq和螢光原位雜交分析的腦結構尺寸中，沒有發現明顯的差異，這意味著mRNA以最小的橫向擴散從組織轉移到珠子。
圖1. 用Slide-seq從組織中捕獲高解析度RNA。（圖片來源：G. Rodriques et al. Science, 2019）
為了將單細胞轉錄組測序技術scRNA-seq的細胞類型映射到Slide-seq的數據上，作者開發了一種稱為非負矩陣分解回歸(NMFreg)的計算方法，它將每個Slide-seq珠的表達重構為scRNA-seq定義的細胞類型特徵的加權組合(圖2A)。將NMFreg應用於小鼠冠狀小腦圓盤概括了經典神經元和非神經元細胞類型(10)的空間分布，例如顆粒細胞、高爾基中間神經元、單極刷狀細胞、Purkinje細胞和少突膠質細胞(圖2B)。NMFreg的映射被發現在一系列因子數和隨機重啟中是可靠的。作者發現65.8±1.4%的珠子可以與單個細胞類型(7)相匹配，而32.6±1.2%的珠子顯示來自兩種細胞類型(平均標準差，N = 7小腦pucks)(圖2C)。Slide-seq的高空間解析度是繪製細胞類型的關鍵:當數據被聚集成更大的特徵尺寸時，組織的異質區域中的細胞類型不能被解析。Slide-seq收集3D組織體積的二維(2D)空間樣本，因此，在沒有適當的體視學控制和採樣方法的情況下，在對整個3D體積進行絕對計數測量時應小心謹慎(11)。
作者首先對從單個小鼠背側海馬區使用pucks捕獲的66個矢狀組織切片，覆蓋9毫米的體積，背側-腹側軸和前-後軸解析度約為10毫米，內側-外側軸解析度約為20毫米(交替的10毫米切片)。150萬個珠子，其中770，000個可以用NMFreg與單個ScRNA-seq定義的細胞類型相關聯，被映射到相應的shor-read數據上。作者沿著內側-外側軸計算地共同配準pucks，允許三維可視化海馬體中的細胞類型和基因表達(圖2D)。作者繪製了由先前定義的齒狀回標記(10)、CA2、CA3、下丘亞群、前定位CA1亞群(以標記Tenm3為例)和經歷有絲分裂和神經發生的細胞組成的基因族。基因族高度表達，並對預期區域具有特異性(圖2E)，證實了Slide-seq定位普通細胞類型和更精細細胞亞群的能力。這66個pucks的整個實驗過程(不包括圓盤的產生)需要大約40人/小時(7)並且只有標準的實驗設備。
圖2. 使用Slide-seq定位小腦和海馬中的細胞類型。（圖片來源： G. Rodriques et al. Science, 2019）
然後，作者開發了一種非參數的、無核的算法來識別pucks上空間非隨機分布的基因(7)。將該算法應用於冠狀切片小腦，將Ogfrl1、Prkcd和Atp2b1識別為高度定位於小腦正下方的區域。特別是，作者發現Ogfrl1是耳蝸背核分子層和梭形層，可能是耳蝸背核車輪細胞(12，13)中細小白蛋白中間神經元的一種特異性和前所未有的標記。作者的算法還鑑定了僅在原發性裂[之前的顆粒細胞中表達的Rasgrf1， (14)，並且進一步的分析揭示了僅在原發性裂(7)之後表達的四個先前未表徵的基因。
小腦的特點是Purkinje的矢狀旁帶基因表達，與Purkinje細胞生理學和投射靶點的異質性相關(15-18)。幾個基因，包括Aldoc(也稱為zebrin II抗體的抗原)，顯示出相似或互補的副矢狀體表達(17，19，20)，但這種表達變異的程度未知，並且這些模式在單細胞測序研究中尚未明確鑑定。利用Slide-seq收集的空間信息，作者鑑定了Purkinje層中的669個空間非隨機基因，其中126個基因與zebrin 模式相關或反相關，分別使用Aldoc和Plcb4作為zebrin patternII-陽性或zebrin II-陰性帶的標記(圖3A)。在抗相關基因中有四個腺苷三磷酸酶和四個鉀通道，其中一些可以解釋zebrin陽性和zebrin陰性Purkinje神經元在電生理學上的差異。此外，除了zebrin模式之外，作者還發現了其他幾種空間基因表達模式。儘管大多數被鑑定的基因顯示出與zebrin II染色一致的模式(圖3)，但有幾個基因在外前庭小腦區(小葉IX和X) 排外地表達或被排除在外(21，22)(圖3D)，證實小葉IX和X具有不同的基因表達程序。還有其他基因在[表現出排斥性表達，例如B3galt5 (7，23)]或排除在(例如Gnai1)第九和第十小葉以及第六和第七小葉之外，表明這些區域可能共享一種基因表達模式，儘管與其相關的認知角色不同 (24)。最後，儘管以前只有Purkinje細胞與醛固酮模式相關，但作者發現，以前主要在肌肉中研究的博格曼細胞標記物Mybpc1在玻片序列和原位數據中似乎都具有zebrin表達模式。因此，作者得出結論，帶狀基因表達模式將許多小腦細胞類型——包括Purkinje、Bergmann神經膠質細胞和顆粒細胞——分成空間上確定的亞群，這在以前的單細胞測序研究中並未指出(10，25)。
圖3. 用Slide-seq鑑定小腦基因表達的變異。（圖片來源： G. Rodriques et al. Science, 2019）
最後，作者應用滑動序列來量化大腦對創傷性腦損傷的反應時間到了。通過損傷後2小時血紅蛋白轉錄物的存在(圖4A)或損傷後3天和2周Vim、Gfap和Ctsd轉錄物的存在(圖4、B和C) (7)，在Slide-seq數據中可見皮質損傷。選擇Vim、Gfap和Ctsd是因為它們是星形膠質細胞(Vim和Gfap)或小膠質細胞(Vim和Ctsd)反應的已知標記，在Slide-seq數據中發現這些反應在損傷時高度上調。作者應用了一種算法來識別所有在空間上與這些轉錄本相關的基因(7)。在2小時的時間點，僅發現Fos和核糖體核糖核酸(rRNA) (26)與損傷在空間上相關(圖4A)。相比之下，在3天的時間點，作者發現小膠質細胞和巨噬細胞分配的珠位於損傷部位，由表達有絲分裂相關因子的不同細胞層(厚度:92.4±11.3毫米，mean ± SE,，N = 3測量值)界定，隨後是星形膠質細胞分配的珠層(圖4D)。最後，在2周的時間點，作者觀察到小膠質細胞和巨噬細胞分配的珠填充損傷，周圍有星形膠質細胞疤痕(厚度: 36.6 ±13.4毫米，mean ± SE,，N= 6次測量)，有證據表明小膠質細胞(但不是巨噬細胞)穿透39±17.8毫米(mean ± SE,，N= 6次測量)，穿過星形膠質細胞瘢痕並進入富含神經元的區域(圖4，E和F)。巨噬細胞使用Lyz2可視化，Lyz2是巨噬細胞和粒細胞的特異性標記；然而，作者將其解釋為巨噬細胞的標誌物，因為沒有發現其他粒細胞特異性標誌物與Gfap、Ctsd和Vim共定位。
為了研究3天和2周時間點之間基因表達的其他變化，作者鑑定了在3天或2周時間點與Vim、Gfap和Ctsd空間相關的基因(7)。應用基因本體論（Gene Ontology）對這些基因組的分析揭示了在3天時間點與染色質分離、有絲分裂和細胞分裂相關的注釋富集(圖4G)，以及在2周時間點與免疫反應(圖4H)、膠質生成(圖4I)和少突膠質細胞發育(圖4J)相關的富集。這一發現表明，細胞增殖發生在損傷後的最初幾天，並在幾周左右向分化過渡。例如，雖然在局灶性灰質損傷後少突膠質細胞祖細胞分化為少突膠質細胞的程度有爭議(27)，但作者證實Sox4和Sox10在2周時間點都位於損傷周圍的區域，表明存在固有的少突膠質細胞。作者還揭示了幾個直接的早期基因的證據，包括高度神經元特異性基因，如Npas4，在損傷周圍0.72±0.19毫米(mean ± SE，N = 4測量值)的寬度區域，在3天和2周時間點(28，30)上調(圖4K)，表明損傷對損傷周圍大面積神經活動的持續影響。
圖4. Slide-seq識別損傷的局部轉錄反應。（圖片來源： G. Rodriques et al. Science, 2019）
作者的研究表明，Slide-seq能夠對冷凍組織中的基因表達進行空間分析，具有高空間解析度和對大組織體積的可擴展性。Slide-seq很容易與大規模單細胞轉錄組測序scRNA-seq數據集整合，有助於在正常和患病組織中發現空間定義的基因表達模式。Slide-seq的主要成本是short-read測序的成本，這裡展示的pucks的成本約為200到500美元。隨著測序成本的進一步下降，期望能夠將載玻片序列擴展到整個器官，甚至整個生物體。作者預計Slide-seq將有助於在複雜組織中定位分子明確的細胞類型，從而定義神經病理狀態中涉及的分子通路。
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參考文獻
1. S. Shah, E. Lubeck, W. Zhou, L. Cai, Neuron 92, 342–357 (2016).
2. K. H. Chen, A. N. Boettiger, J. R. Moffitt, S. Wang, X. Zhuang, Science348, aaa6090 (2015).
3. J. H. Lee et al., Science 343, 1360–1363 (2014).
4. P. L. Ståhl et al., Science 353, 78–82 (2016).
5. E. Z. Macosko et al., Cell 161, 1202–1214 (2015).
6. J. H. Lee et al., Nat. Protoc. 10, 442–458 (2015).
7. Materials and methods are available as supplementary materials.
8. K. L. Gunderson et al., Genome Res. 14, 870–877 (2004).
9. K. B. Halpern et al., Nature 542, 352–356 (2017).
10. A. Saunders et al., Cell 174, 1015–1030.e16 (2018).
11. M. J. West, Neurobiol. Aging 14, 275–285 (1993).
12. L. O. Trussell, D. Oertel, in The Mammalian Auditory Pathways: SynapticOrganization and Microcircuits, D. N. Oliver,
N. B. Cant, R. R. Fay, A. N. Popper, Eds. (vol. 65 of Springer Handbookof Auditory Research Series, Springer, 2018), pp. 73–99.
13. M. T. Roberts, L. O. Trussell, J. Neurophysiol. 104, 2462–2473 (2010).
14. E. S. Lein et al., Nature 445, 168–176 (2007).
15. C. Gravel, R. Hawkes, J. Comp. Neurol. 291, 79–102 (1990).
16. J. Xiao et al., PLOS ONE 9, e105633 (2014).
17. N. H. Barmack, Z. Qian, J. Yoshimura, J. Comp. Neurol. 427, 235–254(2000).
18. N. L. Cerminara, E. J. Lang, R. V. Sillitoe, R. Apps, Nat. Rev.Neurosci. 16, 79–93 (2015).
19. A. Demilly, S. L. Reeber, S. A. Gebre, R. V. Sillitoe, Cerebellum 10,409–421 (2011).
20. G. Brochu, L. Maler, R. Hawkes, J. Comp. Neurol. 291, 538–552 (1990).
21. K. Maekawa, J. I. Simpson, J. Neurophysiol. 36, 649–666 (1973).
22. D. R. W. Wylie, M. R. Brown, I. R. Winship, N. A. Crowder, K. G.Todd, J. Comp. Neurol. 465, 179–194 (2003).
23. C. Chung et al., PLOS Genet. 12, e1006042 (2016).
24. C. J. Stoodley, J. D. Schmahmann, Cortex 46, 831–844 (2010).
25. R. A. Carter et al., Curr. Biol. 28, 2910–2920.e2 (2018).
26. P. D. Storer, K. J. Jones, J. Comp. Neurol. 458, 326–333 (2003).
27. K. L. Adams, V. Gallo, Nat. Neurosci. 21, 9–15 (2018).
28. A. M. Kenney, J. D. Kocsis, J. Neurosci. 18, 1318–1328 (1998).
29. G. A. Robinson, Brain Res. Mol. Brain Res. 24, 43–54 (1994).
30. J. Honkaniemi, S. M. Sagar, I. Pyykönen, K. J. Hicks, F. R. Sharp, BrainRes. Mol. Brain Res. 28, 157–163 (1995).
31. S. G. Rodriques, L. M. Chen, broadchenf/Slideseq: Slide-seq 2019Archive, Version 1.0, Zenodo (2019); https://doi.org/10.5281/zenodo.2571615.
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