CRISPR/Cas系統是目前發現存在於大多數細菌與所有的古菌中的一種免疫系統，被用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防禦系統。在CRISPR/Cas系統中，CRISPR是規律間隔性成簇短回文重複序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）的簡稱，涉及細菌基因組中的獨特DNA區域，也是儲存病毒DNA片段從而允許細胞能夠識別任何試圖再次感染它的病毒的地方，CRISPR經轉錄產生的RNA序列（被稱作crRNA）識別入侵性病毒的遺傳物質。Cas是CRISPR相關蛋白（CRISPR-associated proteins, Cas）的簡稱，Cas蛋白像一把分子剪刀那樣切割細菌基因組上的靶DNA。
然而，目前得到廣泛應用的CRISPR/Cas9系統經常會發生脫靶效應，導致科學家們不想要的結果。作為CRISPR/Cas9系統的一種潛在的對手，CRISPR-Cpf1系統是一類新型的CRISPR-Cas系統，作為基因編輯的新工具，它進一步擴大了基因編輯靶位點的選擇範圍，同時幾乎沒有脫靶效應，已廣泛引起人們的關注。
與過去的CRISPR／Cas9基因編輯系統相比，新的CRISPR／Cpf1基因編輯系統擁有五大優勢：（1）只需一個協助RNA分子。Cas9需要2個RNA分子協助，Cpf1（也稱作Cas12a）只需要一個RNA分子；（2）Cpf1酶分子量比Cas9小，進入細胞更容易，編輯成功率會提高；（3）Cpf1系統不同的識別序列令其基因編輯效果更好；（4）剪切位置與Cas9不同，選擇餘地更大；（5）產生黏性末端，便於新DNA序列插入。
基於此，對近年來CRISPR-Cpf1系統研究取得的進展，進行一番梳理，以饗讀者。
1.Nature：重大發現！史上最簡單的CRISPR/Cpf1系統可切割DNA和RNA doi:10.1038/nature17945
在一項新的研究中，來自德國馬克斯普朗克感染生物學研究所、亥姆霍茲傳染病研究中心和瑞典優密歐大學（Umeå University）的研究人員描述了酶Cas9的一種潛在替代者---來自土拉熱弗朗西絲菌（Francisella novicida）的CRISPR結合蛋白Cpf1---的特徵：Cpf1表現出雙重切割活性：不僅切割DNA，而且也切割RNA。與CRISPR-Cas9不同的是，Cpf1能夠獨自地對crRNA前體（pre-crRNA，編者註：CRISPR DNA片段經轉錄而形成的CRISPR RNA前體）進行加工，然後利用加工後產生的crRNA特異性地靶向和切割DNA，因而也就不需要來自宿主細胞的核糖核酸酶（RNase）和tracrRNA，這是人們迄今為止發現的一種最簡單的CRISPR免疫系統。這一發現可能給科學家們提供一種新的序列特異性基因組編輯方法，更為重要的是，還可能便於一次對多種靶位點進行編輯，即所謂的多重編輯。相關研究結果於2016年4月20日在線發表在Nature期刊上，論文標題為「The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA」。論文通信作者為來自馬克斯普朗克感染生物學研究所的Emmanuelle Charpentier。
CRISPR-Cas是細菌免疫系統的一部分，被用來抵抗病毒感染。在CRISPR-Cas9系統中，酶Cas9在病毒DNA靶位點上進行切割，其中這種靶位點是這樣確定的：一種被稱作CRISPR RNA（crRNA）的RNA分子利用它的一部分序列與另一種被稱作tracrRNA的RNA分子通過鹼基配對結合在一起，形成嵌合RNA（tracrRNA/crRNA），然後，藉助crRNA的另一部分序列與靶DNA位點進行鹼基配對，以這種方式，這種嵌合RNA就能夠引導Cas9結合到這個靶位點上並進行切割，也因此這種嵌合RNA也被稱作嚮導RNA（guide RNA, gRNA）。細菌就利用這種工作機制阻止病毒感染。
如今，研究人員發現發現一些細菌的免疫防禦系統在結構上要比CRISPR-Cas9更加簡單。除了Cas9之外，這些細菌利用酶Cpf1切割外源DNA。這項研究證實Cpf1能夠切割RNA和DNA。Cpf1首先移除crRNA前體的部分序列，輔助後者產生成熟的crRNA。因此，諸如RNase III之類的其他酶是不需要的。成熟的crRNA然後引導Cpf1結合到DNA的靶序列上。
因此，Cpf1具有雙重功能：它對crRNA進行加工讓後者能夠發揮功能，然後在特異性的序列上切割靶DNA。此外，不同於Cas9，Cpf1並不需要tracrRNA分子的幫助結合到靶序列上。因此，它在結構上比CRISPR-Cas9更加簡單。Charpentier解釋道，「CRISPR-Cpf1是一種即插即用的系統，不再需要其他的組分。相反，在自然環境中，CRISPR-Cas9系統需要其他的助手來加以激活。
2.Cell：第二代基因編輯神器誕生，CRISPR/Cpf1讓一切皆有可能！ doi:10.1016/j.cell.2015.09.038
1987年，科學家首次描述了CRISPR序列；2010和2011年，研究人員相繼發現了該序列的自然生物學功能；2013年，張鋒等科學家首次報導了CRISPR-Cas9系統在哺乳動物基因組編輯中的應用。張鋒此前發表過大量Cell,Nature,Science文章，是基因編輯領域的超級新星，也是未來諾貝爾獎有力的爭奪者。
2015年9月22日，發表在《細胞》雜誌上的一項研究中，CRISPR技術先驅、Broad研究所合成生物學家張鋒領導的研究小組找到一種讓該技術更簡單、更精準的方法。一種叫做Cpf1的蛋白可能將克服CRISPR-Cas9系統應用中的一些限制。雖然CRISPR-Cas9系統適用於讓基因失去功能，但是對於真正實現用一個DNA序列的替換另一個還很困難。
儘管CRISPR比之前的基因編輯方法要簡單得多，但是張鋒認為仍有改進的餘地。他和他的團隊搜索了整個細菌王國，找到了一種替代實驗室中常用Cas9酶的選擇。今年4月，相關論文發表在《自然》雜誌上，他們在金黃色葡萄球菌中發現了一個更小版本的Cas9。小的型號讓Cas9酶更容易進入成熟細胞，這類細胞是一些潛在療法的關鍵「目的地」。
雖然研究小組此次發現的Cpf1蛋白與Cas9相比有很多不同，但是也在一些細菌中與CRISPR共同存在。科學家們評估了來自16種不同細菌的Cpf1酶，最終發現有2種Cpf1能夠剪切人類DNA。與Cas9相比，Cpf1有以下四大優勢：
第一， 大小不同。Cas9剪切DNA需要兩個小RNA分子，而Cpf1隻需要一個。Cpf1酶比標準的SpCas9要小，更容易進入組織和細胞。
第二， 剪切方式不同。Cas9是在同一個位置同時剪切DNA分子的雙鏈，最後形成的是分子生物學家常稱的平末端；而Cpf1剪切後形成是兩個不同長度的鏈，被稱之為黏性末端。平末端通常不容易處理。張鋒說：「粘性末端讓DNA插入更可控。」
第三， 剪切位置不同。Cpf1剪切時離識別位點很遠，這讓研究人員在編輯位置的選擇上有了更多的選項。
第四， Cpf1系統在目標位置的選擇上提供了靈活性。像Cas9一樣，Cpf1複合物首先必須連接一個叫做PAM的短序列，目標位置必須是與天然存在的PAM序列相鄰。與Cas9相比，Cpf1複合物識別的PAM序列是非常不同的。
3.Nucleic Acids Res：上海生科院在Cpf1蛋白切割機理方面取得新進展 doi:10.1093/nar/gkx018
The CCTL (Cpf1-assisted Cutting and Taq DNA ligase-assisted Ligation) method for efficient editing of large DNA constructs in vitro 1月11日，國際學術期刊《核酸研究》（Nucleic Acids Research）在線發表了中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態研究所趙國屏研究組題為The CCTL (Cpf1-assisted Cutting and Taq DNA ligase-assisted Ligation) method for efficient editing of large DNA constructs in vitro 的研究論文。該工作鑑定了Cpf1蛋白的精確切割位點，並基於該切割特性開發新的DNA無縫拼接方法。
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是存在於原核生物中的獲得性免疫系統，CRISPR相關蛋白Cas9已廣泛應用於基因組編輯和許多其他應用當中。Cpf1蛋白隸屬於II類type V CRISPR系統。相比於Cas9蛋白，Cpf1蛋白具有類似的基因組編輯效率，但具有較低的脫靶效應，在基因治療應用中具有巨大的潛力。不同於Cas9，Cpf1由單個crRNA指導，並利用富含T的protospacer相鄰基序（PAM）序列切割雙鏈DNA（dsDNA）靶標，形成5-nt粘性末端。Cpf1的切割特性使得其成為有效的體外DNA拼接工具，並且最近的研究中報導了基於Cpf1消化和T4DNA連接酶介導的連接建立的DNA拼接標準C-Brick。
在該研究中，研究人員發現，Cpf1切割靶標DNA並不像之前報導的那樣，只切割靶標DNA互補鏈的23位和非互補鏈的18位，而是在非互補鏈的14位到18位形成多個切割位點。除此之外，該文研究人員還發現Cpf1的切割位點受到crRNA spacer序列長度的影響。當spacer序列長度大於等於20的時候，Cpf1傾向於切割非互補鏈的18位，而當spacer序列長度小於20的時候，Cpf1傾向於切割非互補鏈的14位。基於Cpf1在較短spacer長度的crRNA介導下，可以特異切割靶標DNA的14位與22位，形成8－nt的長黏性末端的特性，結合Taq DNA連接酶高精度的連接特性，研究人員將其開發為一個大DNA片段體外無縫編輯的新工具。在應用實例中，研究人員成功將30kb的放線紫紅素合成基因簇內部調控基因actII-orf4 的啟動子進行了原位的替換。經過反應條件的優化，替換的陽性率達到70%以上。該方法為大片段體外編輯提供了一個高效工具。
4.Nat Commun：上海生科院建立高效穀氨酸棒桿菌CRISPR-Cpf1基因組編輯系統 doi:10.1038/ncomms15179
5月4日，《自然-通訊》（Nature Communications）發表了中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態研究所合成生物學重點實驗室楊晟研究組題為CRISPR-Cpf1 assisted genome editing of Corynebacterium glutamicum 的研究成果，發現弗蘭西斯菌來源的Cas效應蛋白(FnCpf1)與穀氨酸棒桿菌適配，而SpCas9則表現出對穀氨酸棒桿菌的毒性，並建立了高效的穀氨酸棒桿菌CRISPR-Cpf1基因組編輯系統。
CRISPR-Cas是當前最強有力的基因組編輯技術。基於化膿鏈球菌來源的Cas效應蛋白（SpCas9）最初被開發為人類細胞的基因組編輯工具，隨後被適配到各個物種細胞中，被認為是「戰無不勝攻無不克」的Cas效應蛋白。但在穀氨酸棒桿菌這一最重要的胺基酸生產菌株中，SpCas9卻難以適配應用。
楊晟研究組開發的這套CRISPR-Cpf1基因組編輯方法，結合單鏈重組系統實現了基因組精細修改，最高效率達到100%；亦可實現大片段缺失和插入，將原先每輪一周的基因組編輯操作縮短到3天。以L-脯氨酸合成代謝關鍵酶γ-穀氨醯激酶的149位甘氨酸為例，應用CRISPR-Cpf1基因組編輯系統對其實施原位飽和點突變，可成功篩選獲得抗L-脯氨酸反饋抑制的高產菌株。
5.Nature：新型基因編輯Cpf1/CRISPR的RNA複合物被中國學者破譯 doi:10.1038/nature17944
來自哈爾濱工業大學、清華大學的研究人員報告稱，他們獲得了Cpf1/CRISPR RNA複合物的晶體結構。這一重要的研究成果發布在4月20日的《自然》（Nature）雜誌上。
在這篇Nature文章中，作者們報告稱獲得了結合CRISPR RNA (crRNA)的毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium) ND2006 Cpf1 (LbCpf1)的晶體結構，解析度達到2.38埃（Å）。他們發現LbCpf1具有一種三角形體系結構，中心有一個大的正電荷通道。被LbCpf1的寡核苷酸結合結構域所識別，crRNA採用了一種高度扭曲的構象，廣泛的分子內互作和(Mg(H2O)6)2+離子對這一構象起穩定作用。LbCpf1的寡核苷酸結合結構域還包含一個環凸(looped out)螺旋結構域，其對於LbCpf1底物結合至關重要。結合crRNA或缺乏嚮導序列的crRNA均可誘導LbCpf1顯著的構象改變，但不能誘導LbCpf1低聚化。
新研究揭示出了crRNA的識別機制，提供了crRNA引導LbCpf1底物結合的一些新見解，為設計改造LbCpf1提高基因編輯的效率和特異性建立了一個框架。
6.Mol Plant：逆境中心利用CRISPR/Cpf1系統簡單高效實現水稻多基因定點編輯 doi: 10.1016/j.molp.2017.03.001
近年來，科學家發現並改造出Cpf1 (CRISPR from Prevotella and Francisella 1)系統，研究表明該系統能克服CRISPR/Cas9的上述局限，它不需要tracrRNA的輔助，並且Cpf1蛋白兼具DNA剪切酶和RNA修剪酶的功能，不但能靶向切割DNA雙鏈，而且能把相應的非成熟型CrRNA(pre-crRNA)加工剪切成成熟型CrRNA。
3月18日，Molecular Plant雜誌在線發表了中國科學院上海生命科學研究院植物逆境生物學研究中心朱健康課題組題為「Multiplex Gene Editing in Rice using the CRISPR-Cpf1 System」的研究論文。
該工作利用Francisella novicida Cpf1 (FnCpf1)和 Lachnospiraceae bacterium ND2006 Cpf1 (LbCpf1)對水稻進行單位點和多位點基因敲除的測試，研究表明上述兩個Cpf1隻需一條非常短的20-21bp的直接重複序列（direct repeats, DR）加上22-24bp的靶位點識別序列（guide）即可實現單基因敲除，更重要的是，把多個DR-guide單元直接串聯，只需要一個啟動子驅動即可簡單高效地實現多基因敲除。該研究利用4個DR-guide單元組成的CrRNA短陣列分別對水稻RLK和CYP81A家族的四個基因進行編輯，各位點的敲除效率達到40-75%。該系統簡單、高效地在水稻中實現了多基因定點編輯，拓展了CRISPR系統在植物中的應用，為水稻基因組定點編輯提供了一個新利器。
7.Nat Biotechnol：證實CRISPR/Cpf1基因組編輯幾乎沒有脫靶效應 2016年6月6日，doi:10.1038/nbt.3609
作為CRISPR基因組編輯的新工具，Cpf1因其不同於Cas9的性質而引起人們的廣泛關注。它只需要單個RNA，即crRNA（CRISPR RNA），因而組裝更加簡單；它的交錯切割模式可能促進利用所需的序列替換現有的DNA序列；它識別富含胸腺嘧啶的DNA序列，而且相對於Cas9識別的富含鳥嘌呤的序列，人們很少探討這種序列。總之，Cpf1有望擴大CRISPR基因組編輯靶位點的範圍，同時具有更好的編輯效率。
儘管Cpf1有巨大潛力成為一種強大的基因組編輯工具，但是人們很少證實這種新的工具如何特異性地找到它的靶位點。在一項新的研究中，來自韓國基礎科學研究所（IBS）基因組編輯中心的研究人員證實作為一種高度特異性的可編程工具，Cpf1適合用於精確的基因組編輯。相關研究結果於2016年6月6日在線發表在Nature Biotechnology期刊上，論文標題為「Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells」。
研究人員使用了兩種類型的Cpf1家族蛋白（AsCpf1和LbCpf），這是因為它們是同類蛋白中編輯效率最高的，並開展Digenome-seq測試：他們設計出的一種測試方法以便在全基因組中鑑定出Cpf1能夠進行切割的靶位點（on-target site）和脫靶位點（off-target site）。不含細胞的基因組DNA是從人細胞中分離出的，然後利用事先組裝的重組Cpf1核糖核蛋白（RNP，編者註：由crRNA和Cpf1進行組裝而形成）對該基因組DNA進行切割，隨後進行全基因組測序。通過對對應於體外靶切割位點和脫靶切割位點的測序序列片段進行比對，就可通過計算鑑定出這些位點。
基因組分析表明Cpf1是高度特異性的，與Cas9相比，只有更少的脫靶切割位點（對LbCpf1而言是6個，對AsCpf1而言是12個），而Cas9能夠切割人基因組上的90多個位點。特別地，在大多數體外脫靶切割位點中，代表脫靶效應的核苷酸插入或刪除（insertion or deletion, indel）發生率低於0.1%，遠低於對應的靶位點上的indel發生率，這提示著這兩種Cpf1蛋白幾乎沒有脫靶效應。
8.Sci Adv：重磅！研究人員使用CRISPR-Cpf1治療杜氏肌營養不良 2017年4月12日，doi:10.1126/sciadv.1602814
德州大學西南醫學研究中心研究員利用新的基因編輯酶CRISPR-Cpf1在實驗室了人類細胞和老鼠體內的杜氏肌營養不良。該研究組過去使用原有的基因編輯系統CRISPR-Cas9糾正患有此病的老鼠模型和人類細胞內的杜氏肌缺陷。在目前的研究中，他們使用一種新的基因編輯系統，用於修復老鼠模型和人類細胞中的缺陷。
「我們研究了最常見的導致杜氏肌營養不良的患者細胞。我們在體外對它們進行糾正，以恢復細胞內缺失的抗肌營養不良蛋白。這項研究提供給了我們CRISPR工具箱中一個很有潛力的工具，」 Wellstone肌肉萎縮聯合研究中心、Hamon再生科學和醫學中心主任、分子生物學主席Eric Olson博士說。該研究發表於Science Advances雜誌。
CRISPR-Cpf1在很多關鍵方面不同於CRISPR-Cas9。Cpf1比Cas9酶小很多，這就使之更容易包裝到病毒內，因此也更加容易進入肌細胞。與Cas9 相比，它也能識別不同的DNA序列。就其實用性而言，它提供了更大的靈活性。「有一些基因很難用Cas9編輯，但是更容易用Cpf1修飾。因為這兩種蛋白質有不同的生化性質，能識別不同的DNA序列，所以這些特性能為基因編輯創造更多的選擇，」先天性心臟缺陷研究傑出教授Olson博士說。
「通過敲除突變區域或精確修復突變基因，CRISPR-Cpf1介導的基因編輯不僅糾正了杜氏肌萎縮症突變，而且還改善了肌肉收縮能力和強度，」分子生物學教授、Hamon再生科學和醫學研究中心副主任、Rhonda Bassel的合著者Duby博士說。
9.Nat Biotechnol：張鋒再發CRISPR新突破！「魔剪」可實現同時編輯4個基因 2016年12月5日doi:10.1038/nbt.3737
12月5日，Nature Biotechnology雜誌在線發表了題為「Multiplex gene editing by CRISPR–Cpf1 using a single crRNA array」的研究成果。CRISPR先驅張鋒以及Wageningen大學的John van der Oost是這篇論文的共同通訊作者。
近幾年，CIRSPR技術飛速發展，除了「元老」CIRSPR/Cas9系統，科學家們還找到了一些新「選手」。2015年9月，張鋒研究組在Cell雜誌上發表的一篇論文中首次提出了新型基因編輯系統CRISPR/Cpf1。Broad研究所Eric Lander教授稱，該研究證明了Cpf1在編輯人類基因組中非凡強大的功能。
在這項新研究中，科學家們發現，CRISPR/Cpf1系統能夠克服Cas9靶向多個基因位點的限制。研究表明，Cpf1加工自身CRISPR RNA （crRNA）的能力可用於簡化多重基因組編輯。使用單個定製的CRISPR陣列（array），研究人員實現了在哺乳動物細胞中同時編輯多達4個基因，在小鼠大腦中同時編輯3個基因。
10.Cell & Cell Res：解析出Cpf1-crRNA-靶DNA三元複合物的晶體結構 doi:10.1016/j.cell.2016.04.003; doi:10.1038/cr.2016.88
為了闡述Cpf1如何識別和剪切DNA，MIT的張峰研究組和東京大學Osamu Nureki教授、中國科學院生物物理研究所的高璞研究組與紀念斯隆-凱特琳癌症中心的研究人員先後解析了AsCpf1-crRNA-DNA三元複合物晶體結構。
Cpf1和Cas9的核糖核蛋白三元複合物具有相似的整體結構。AsCpf1與Cas9同樣採用二裂片結構，外觀呈蟹鉗狀，分為識別葉 (Recognition lobe，REC) 和核酸酶葉 (Nuclease lobe，NUC)。但不同的是，Cas9核酸酶葉包含RuvC和HNH兩個核酸酶結構域，分別負責切割非靶向和靶向DNA鏈，產生平末端；而AsCpf1的NUC葉沒有HNH結構域，由RuvC結構域和一個推定的新的核酸酶結構域 (Nuc) 組成，分別負責切割非靶向及靶向DNA鏈，產生黏性末端。RuvC剪切非靶向DNA鏈是Nuc剪切靶向DNA鏈的先決條件。
另外，Cpf1-crRNA二元複合物和Cpf1-crRNA-DNA三元複合物的結構的比較也揭示了Cpf1與Cas9不同的DNA識別機制。
首先，sgRNA和crRNA上靠近PAM序列的區域均存在一段「種子序列」，可與靶DNA序列互補配對，對於Cas9和Cpf1識別和切割DNA至關重要。由於sgRNA和crRNA在二元複合體中呈現不同的構象，「種子序列」在Cas9-sgRNA二元複合體中形成有序的A型結構，而在Cpf1-crRNA二元複合體中是無序的，在Cpf1-crRNA-DNA三元複合體中才轉變為有序的A型結構。
其次，PAM互作裂縫在Cas9-sgRNA二元複合體中也已預先形成，是Cas9識別目標DNA的另一個關鍵結構，但在Cpf1-crRNA二元複合體中還未形成，目標DNA的結合誘導Cpf1內部結構重排，多個結構域發生空間位移，PAM互作裂口經歷一個「從開到關」的構象改變，以容納有序的A型種子序列和靶DNA在正電荷通道內形成異源雙鏈核酸分子。
Cpf1識別目標DNA時種子序列「從無序到有序」和PAM互作裂縫「從開到關」的構象變化，可能有利於降低其基因編輯的脫靶效應。
11.Nat Biotechnol：張峰研究組擴展CRISPR/Cpf1 的靶點選擇範圍
doi: 10.1038/nbt.3900
6月5日，Nature Biotechnology雜誌在線發表張峰研究團隊題為「Engineered Cpf1 variants with altered PAM specificities」 研究論文，通過突變AsCpf1和LbCpf1的方法，擴大了靶點選擇範圍。
CRISPR/cpf1自被發現以來，已經在不同物種中得到應用，但其靶點選擇僅限於PAM為TTTV 的DNA序列，研究人員通過篩選突變體的方式擴大了PAM位點的選擇範圍，例如 AsCpf1突變S542R/K607R 和 S542R/K548V/N552R後可以分別識別PAM為 TYCV 和TATV的DNA序列，並且提高了活性。全基因組範圍脫靶分析表明這些突變體對其高特異性並沒有影響，LbCpf1同樣的突變位點表現出相同的結果。
12.Nat Chem Biol：突破！科學家成功優化CRISPR-Cpf1技術使其更加高效地編輯人類基因組doi:10.1038/nchembio.2410
近日，一項刊登在國際雜誌Nature Chemical Biology上的研究報告中，來自斯克裡普斯研究所的研究人員通過研究改善了當前最先進的基因編輯技術，使其能夠更加精準地靶向切割並且粘貼人類和動物細胞中的基因，同時研究者還擴展了CRISPR-Cpf1基因編輯系統使其能夠用來研究以及幫助抵禦人類疾病。 文章中，研究人員通過將導向RNAs和「復用」能力合併，改善了CRISPR-Cpf1基因編輯系統的作用效率；研究者Guocai Zhong說道，這種系統能夠簡單、明顯改善同時對多個基因或單個基因多個位點的編輯能力，這或許對於靶向作用多個疾病相關的基因或疾病相關基因的多個位點非常有幫助。
研究者Farzan指出，效率是非常重要的，如果你能夠修飾肝臟中的25個細胞，似乎是無意義的，但如果能夠對肝臟中一半的細胞進行修飾，那麼這或許具有重大意義。當然如果該系統還能夠幫助修復肌肉細胞中基因的話，或許就能夠幫助恢復患者的肌肉功能。目前Cas9和Cpf1是最常用的兩種分子剪刀，研究者Farzan重點對Cpf1進行關注，因為其能夠更加精確地對哺乳動物細胞進行作用，Cpf1分子來自兩種類型的細菌：拉克諾螺旋菌科細菌和嗜酸菌屬細菌，這些分子的關鍵特性就是能夠對RNAs進行引導，但目前研究人員並不清楚這些分子如何同哺乳動物細胞所產生的RNA發生作用，文章中，研究者通過將螢火蟲發光基因編輯到細胞的染色體中進行深入研究，隨後他們發現，這種修飾後的CRISPR-Cpf1系統能夠像預期一樣發揮作用。
13.Nat Commun：利用CRISPR/Cpf1改進大豆油中的脂肪含量 doi:10.1038/ncomms14406
在一項新的研究中，來自韓國基礎科學研究所（Institute for Basic Science, IBS）基因組工程中心的研究人員利用新的CRISPR-Cpf1技術成功地對改變大豆油中的脂肪含量的兩個基因進行編輯。CRISPR-Cpf1是一種更為廣泛使用的基因編輯工具CRISPR-Cas9的替代性方法。這種新的植物基因編輯方法對大豆和野生菸草基因進行編輯取得的結果於2017年2月16日在線發表在Nature Communications期刊上，論文標題為"CRISPR/Cpf1-mediated DNA-free plant genome editing"。
IBS研究人員設計CRISPR-Cpf1複合物對大豆中的兩個FAD2基因進行切割。這兩個基因是將油酸（一種脂肪酸）轉化多不飽和亞油酸（另一種脂肪酸）的通路的一部分。通過讓這兩個FAD2基因發生突變，大豆種子中的油酸比例增加了，這導致更加健康的脂肪含量產生。
IBS研究人員也證實CRISPR-Cpf1並不能夠切割大豆基因組中的非靶標位點。這些結果證實CRISPR-Cpf1是一種高度有效的技術。再者，這種方法是100%的不含有DNA（DNA-free）。它通過化學合成crRNA而無需導入外源DNA。這消除了外源DNA（用作RNA合成的模板）殘留的風險。
IBS研究人員也發現相比於CRISPR-Cas9，CRISPR-Cpf1具有至少三種益處：CRISPR-Cpf1技術具有更短的crRNA，因此能夠化學合成這種RNA；CRISPR-Cpf1在靶基因上產生更大的序列刪除（7個鹼基對），因而讓這種基因完全失去作用；Cpf1的切割類型可能有助優化基因編輯過程。
14.Nature：從結構上揭示CRISPR-Cpf1的DNA靶向機制
doi:10.1038/nature22398
在一項新的研究中，來自丹麥哥本哈根大學的研究人員發現了一種新的被稱作Cpf1的分子剪刀如何讓DNA解鏈，並對它進行切割。這個CRISPR-Cas家族成員表現出較高的準確性，能夠像全球定位系統（GPS）那樣發揮作用以便鑑定出基因組中的靶位點。Cpf1的高精準度將會改進這種技術在修復基因損傷、其他醫學應用和生物技術應用上的使用。
這些研究人員成功地可視化觀察和描述了Cpf1的工作方式。這種蛋白屬於Cas家族，能夠切割雙鏈DNA，因而允許啟動這種基因組修飾過程。相關研究結果發表在2017年6月22日的Nature期刊上，論文標題為"Structure of the Cpf1 endonuclease R-loop complex after target DNA cleavage"。論文通信作者為哥本哈根大學研究員Guillermo Montoya和Stefano Stella。
Montoya說，"我們利用X射線照射Cpf1蛋白晶體，能夠在原子解析度上觀察到它的結構，從而能夠讓我們觀察它的所有組分。X射線衍射是被用來解析生物分子結構的主要生物物理學技術之一。"
"Cpf1的主要優勢在於它的高度特異性和DNA切割方式，這是因為利用這種新的分子剪刀能夠產生交錯末端，而不是Cas9產生的平端斷裂。這些交錯末端有利於DNA序列插入。"
15.Cell：張鋒發表綜述詳細介紹第二類CRISPR-Cas系統 doi:10.1016/j.cell.2016.12.038
近期張鋒教授也與另外兩位學者在Cell雜誌上發表了題為「SnapShot: Class 2 CRISPR-Cas Systems」的特寫文章，介紹了新一代CRISPR基因組編輯系統：Class 2 CRISPR-Cas Systems。 2015年，張鋒及其同事們就報告稱發現了一種不同的CRISPR系統，具有潛力實現更簡單、更精確的基因組工程操作。這個新系統是通過在不同類型的細菌中搜尋了成百上千種的CRISPR系統，尋找具有有用特性的酶，結果來自胺基酸球菌屬（Acidaminococcus）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）的Cpf1酶成為新的候選物。
這一新發現的Cpf1系統有幾個重要的方面不同於以往描述的Cas9，在生物通最先報導的張鋒Cell：新一代CRISPR基因組編輯系統這篇文章中就提到：Cpf1系統更簡單一些，它只需要一條RNA。Cpf1酶也比標準SpCas9要小，使得它更易於傳送至細胞和組織內；Cpf1以一種不同於Cas9的方式切割DNA。當Cas9複合物切割DNA時，它切割的是同一位點的兩條鏈，留下的「平端」（blunt ends）在重新連接時往往會發生突變。採用Cpf1複合物生成的兩條鏈切口是偏移的，在裸露端留下了短懸端（overhang）。這預計有助於精確插入，使得研究人員能夠更有效及精確地整合一段DNA；Cpf1切口遠離識別位點，這意味著即便在切割位點靶基因突變，仍然可以進行再度切割，提供了多次機會來校正編輯；Cpf1系統為選擇靶位點提供了新的靈活性。像Cas9一樣，Cpf1複合物必須首選附著PAM,短序列，選擇的靶點靠近自然存在的PAM序列。Cpf1系統識別的PAM序列與Cas9截然不同。這在靶向某些基因組如瘧原蟲及人類基因組時可能是個優勢。
文章指出，第二類CRISPR-Cas系統基於不同的效應蛋白家族，可以分為3種類型和9種亞型，其中譬如Cas9和Cas12a（Cpf1）已成功地用於基因組工程。在此前的研究中，張鋒研究組也採用了一種新生物信息學方法來發現暫時被命名為C2c1、C2c2和C2c3的新蛋白，他們開發出一系列的計算方法來搜索NIH基因組資料庫，鑑別新的CRISPR-Cas系統。
16.Nat Biotechnol：在體內利用電穿孔運送CRISPR/Cpf1實現靶向突變 doi:10.1038/nbt.3596
作為CRISPR基因組編輯的新工具，Cpf1因其不同於Cas9的性質而引起人們的廣泛關注。它只需要單個RNA，即crRNA（CRISPR RNA），因而組裝更加簡單；它的交錯切割模式可能促進利用所需的序列替換現有的DNA序列；它識別富含胸腺嘧啶的DNA序列，而且相對於Cas9識別的富含鳥嘌呤的序列，人們很少探討這種序列。總之，Cpf1有望擴大CRISPR基因組編輯靶位點的範圍，同時具有更好的編輯效率。
在一項新的研究中，來自IBS基因組編輯中心的一個研究團隊成功地將Cpf1核糖核蛋白（RNP，編者註：由crRNA和Cpf1進行組裝而形成）介導的突變引入小鼠胚胎中，培育出突變小鼠。他們選擇發生突變的靶基因為Foxn1（一種調節免疫系統的轉錄因子，可促進皮膚毛髮生長）和Tyrosinase（編碼酪氨酸酶，該酶催化黑色素產生，其中黑色素是天然色素，能夠確定皮膚的顏色）。相關研究結果於2016年6月6日在線發表在Nature Biotechnology期刊上，論文標題為「Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins」。
論文第一作者HUR K Junho說，「這些數據表明將Cpf1 RNP運送到小鼠胚胎中導致靶基因發生突變而破壞它們的功能，它們的突變率分別為64%和33%。我們將突變的小鼠胚胎移植到代孕母小鼠體內，獲得攜帶特定突變的小鼠。這些突變分別導致無毛髮的小鼠和白髮小鼠產生。」
Hur補充道，「為了研究Cpf1是否有脫靶效應，我們對從一隻Foxn1基因發生突變的小鼠和它的野生型近親小鼠體內分離出的基因組DNA進行全基因組測序。序列分析表明沒有脫靶突變發生。對其他突變小鼠的DNA進行靶向深度測序（targeted deep sequencing）也顯示沒有發生脫靶突變。」
在這項研究中，研究人員採用電脈衝將Cpf1 RNP同時滲透進多達50個小鼠胚胎中。這種新的電穿孔技術運送用於基因組編輯的Cpf1 RNP到小鼠胚胎中，產生突變小鼠。相比於常規的微注射技術，這種電穿孔方法很容易開展、快速和具有可擴展性。
(來源：生物谷)