羅氏分子診斷平臺技術與原理介紹

2022-02-01 石頭道科普

羅氏作為全球頂級的分子診斷企業，在之前介紹HPV、HIV及現在的HBV和HCV都能看到羅氏產品的身影。本推送主要介紹目前羅氏分子診斷主要的檢測平臺和技術原理，包括其全自動核酸分離系統、全自動PCR系統，全自動核酸提取及PCR系統及其模塊化血篩平臺。由於系統十分複雜，也僅能做個基本的匯總介紹。感興趣的可以私下交流。

核酸提取是下遊核酸檢測、研究和產品開發的起點，所分離的核酸質量和完整性直接影響研究或診斷結果，因此核酸提取是分子生物學的關鍵之一。通常，核酸分離純化需要4個步驟：組織或者細胞的破碎和裂解；核蛋白複合體的變性；核酸酶的滅活及汙染物的去除。理想情況下，我們不僅可以獲得高質量的靶核酸，也沒有蛋白、糖等其它物質的汙染。

全自動核酸提取儀主要基於磁珠吸附法。具體原理如下：

DNA在半保留複製時，雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性裂解成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據鹼基互補配對原則複製成同樣的兩份拷貝。在實驗條件下，DNA在高溫時也可以發生變性裂解，當溫度降低後又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，並設計引物作為啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定序列的體外複製。總結起來，PCR就類似於DNA的天然複製，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的引物。PCR由變性-復性-延伸3個基本過程構成。

實時螢光PCR主要基於螢光共振能量轉移（FRET），當兩個螢光基團靠近時，高能量的螢光基團激發的能量轉移到靠近的低能量的螢光基團。通過標記設計對兩種螢光基團所發出的螢光信號的實時監控，就能得到PCR擴增時，產物的數量變化，從而實現實時檢測的目的。目前，根據螢光基團在寡核苷酸探針上的不同標記形式，各種螢光PCR檢測試劑盒所採用的螢光探針基本可以分為三種類型：TaqMan探針、分子信標和螢光雜交探針，三種標記的特點如下表所示。其中羅氏的螢光PCR系統主要採用TaqMan探針進行寡核酸標記。

羅氏分子診斷主要有下面一些平臺，涵蓋了全自動核酸分離純化儀、全自動PCR儀、全自動核酸提取及PCR分析儀和全自動模塊化血篩系統。每個系統的主要技術原理和技術分類如下表所示。

工作原理

Cobas AmpliPrep使用液相探針捕獲技術從樣本中特異性分離RNA和DNA。基本的原理是：在徹底裂解病毒顆粒後，加入生物素標記的靶基因特異捕獲探針；在雜交過程中，靶基因（RNA或DNA）與探針特異性結合；加入鏈黴親和素包被的磁珠，通過生物素和鏈黴親和素的高效特異性結合，探針-靶基因結合至磁珠表面形成複合物，這種複合物在磁場作用下可以被方便地洗滌、重懸，最終產物轉移至新的密閉管，從而獲得高純度的特異性病毒核酸。

探針捕獲技術的關鍵是探針和靶基因序列的匹配，通過探針的設計，使病毒的各基因亞型在後續的PCR檢測過程中都能夠被靈敏、特異的擴增，以滿足Cobas TaqMan平臺上的PCR檢測要求。

儀器構造

下面的視頻展示了Cobas AmpliPrep的工作原理和儀器構造。儀器主要分為指示欄；進樣架子；樣本處理單元；試劑架；樣本試劑條碼掃描儀器；清洗臺；重懸臺和機械臂。在樣本加入後，有專用的試劑通道傳送試劑，避免樣本之間的交叉感染。專用的樣本移液管帶有精心設計的塞子，主要用於樣本的混合和轉移。樣本主要在60℃區裂解，在37℃與磁珠結合，且樣本移液管從60℃轉移到37℃時，管子底端始終不超過保護槽。在洗滌過程中，所有的上清液都被轉移至廢液區，避免之後的樣本汙染。

工作原理

該系統主要用於擴增並檢測Cobas AmpliPrep得到的核酸分子。採用的技術原理是實時螢光定量PCR，標記的探針為TaqMan探針。羅氏有兩款產品，分別是Cobas TaqMan和Cobas TaqMan 48分析儀。主要區別在於熱循環模塊的數目不同。具體原理如圖所示。反應初始探針不顯示螢光，隨著反應的進行，DNA聚合酶的核酸外切酶活性將探針切斷並釋放出兩種螢光染料。這個剪切過程使報告基團的猝滅劑消除，導致螢光分子信號的增強。

儀器構造

不管是Cobas TaqMan還是Cobas TaqMan 48分析儀，它們主要都包含3個部分：熱循環系統；螢光光度計系統；樣本處理系統。下圖展示了Cobas TaqMan 48分析儀的主要構件。熱循環系統（TC）包含兩個獨立的單元，每個部分都能夠容納24個樣品，可以同時進行擴增和檢測。其中樣本被裝載在一個叫做K-carrier的儀器上，並由K-carrier傳輸儀進行傳輸。螢光光度計系統分為2個24道的螢光光度計，激發光源是鎢滷素燈。這裡設計比較巧妙的地方是激發光通過4個不同的過濾器的組合，並由步進電機推動旋轉進行24道的同時檢測。Cobas TaqMan比Cobas TaqMan 48分析儀多了2個獨立的熱循環系統，加入了樣本載入區，一次可裝載4個K-carrier樣本架，共計96個樣本。

檢測原理

LightCycler有多種平臺，LightCycler 96、LightCycler 480和LightCycler 1536。LightCycler最大的特點是採用的96或者384孔板進行PCR反應，同時螢光染料的選擇上並沒有特殊要求，是一個較為公用的檢測平臺。該系統採用Therma-Base熱循環技術(專利號US Patent No.5161609)、導熱性能好的銀質熱循環模塊和先進的光學檢測系統，徹底消除邊緣效應，保持穩定優質的檢測結果，且整個過程中無需使用ROX等內參染料，有效節約成本。

儀器構造

下面的視頻大致講解了LightCycler的儀器構造。LightCycler主要由光源、溫控單元、光學元件、檢測器和數據處理系統組成。光源採用白光LED；溫控模塊採用Peltier加熱模塊。在加熱模塊和冷卻元件之間引入專利技術Therms-Base氣液對流平衡層，確保精確可靠的熱循環過程，溫度均一性為±0.1℃。螢光系統可同時檢測6種螢光色標記的靶標。其激發波長440—618nm，檢測波長為488-660nm。

Cobas 4800是一款非常經典的全自動核酸提取及螢光PCR分析系統。該系統集成了cobas x 480全自動核酸分離純化儀和cobas z 480 PCR儀。

全自動核酸分離與純化

樣本先在高溫、蛋白酶、SDS及裂解液的處理下，DNA變性釋放，再由磁珠顆粒吸附捕獲釋放DNA。在磁性板架的配合下，通過低pH緩衝液進行DNA的清洗及低鹽緩衝液的DNA純化。反應最後，加入PCR緩衝鹽和DNA聚合酶，完成PCR反應體系的建立。

目標DNA的PCR擴增和檢測

具體原理和之前介紹的TaqMan系統類似。其中，該系統加入β-globin DNA作為內控，實現對樣本的採集、DNA的提取及擴增檢測進行全程監控。

Cobas s 201是羅氏一套模塊化的全自動核酸血液篩查系統。其主要包括Hamilton STAR自動混樣儀、Cobas AmpliPrep全自動核酸分離純化儀、Cobas TaqMan全自動螢光PCR儀和相應的連接系統。配合Cobas TaqScreen MPX檢測試劑盒，能夠對血液中HIV、HBV和HCV進行檢測，實現多種傳染病毒的實時鑑別。

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