| 一、核酸及蛋白質常用數據 1．核苷三磷酸的物理常數 化合物 分子量 λmax(pH7.0) 1摩爾溶液（pH7.0）中λmax時的最大吸收值 OD280/OD260 ATP 507 259 15400 0.15 CTP 483 271 9000 0.97 GTP 523 253 13700 0.66 UTP 484 262 10000 0.38 dATP 494 259 15200 0.15 dCTP 467 271 9300 0.98 dGTP 507 253 13700 0.66 dTTP 482 267 9600 0.71 2．常用核酸的長度與分子量 核酸 核苷酸數 分子量 λDNA 48502（雙鏈環狀） 3.0×107 pBR322 4363（雙鏈） 2.8×106 28SrRNA 4800 1.6×106 23SrRNA 3700 1.2×106 18SrRNA 1900 6.1×105 19SrRNA 1700 5.5×105 5SrRNA 120 3.6×104 tRNA（大腸桿菌） 75 2.5×104 3．常用核酸蛋白換算數據 （1）重量換算 1μg=10-6g 1pg=10-12g 1ng=10-9g 1fg=10-15g （2）分光光度換算： 1A260雙鏈DNA=50μg/ml 1A260單鏈DNA=30μg/ml 1A260單鏈RNA=40μg/ml （3）DNA摩爾換算： 1μg 100bp DNA=1.52pmol=3.03pmol末端 1μg pBR322 DNA=0.36pmol 1pmol 1000bp DNA=0.66μg 1pmol pBR322=2.8μg 1kb雙鏈DNA（鈉鹽）=6.6×105道爾頓 1kb單鏈DNA（鈉鹽）=3.3×105道爾頓 1kb單鏈RNA（鈉鹽）=3.4×105道爾頓 （4）蛋白摩爾換算： 100pmol分子量100，000蛋白質=10μg 100pmol分子量50，000蛋白質=5μg 100pmol分子量10，000蛋白質=1μg 胺基酸的平均分子量=126.7道爾頓 （5）蛋白質/DNA換算： 1kb DNA=333 個胺基酸編碼容量=3.7×104MW蛋白質 10，000MW蛋白質=270bp DNA 30，000MW蛋白質=810bp DNA 50，000MW蛋白質=1.35kb 100，000MW蛋白質=2.7kb DNA 4．常用蛋白質分子量標準參照物 （1）高分子量標準參照 （2）中分子量標準參照 （3）低分子量標準參照 肌球蛋白 分子量 磷酸化酶B 97，400 碳酸酐酶 31，00 肌球蛋白 212，000 牛血清白蛋白 66，200 大豆脻蛋白酶 21，500 β-半乳糖甘酶B 116，000 穀氨酶脫氫酶 55，000 抑制劑 磷酸化酶B 97，400 卵白蛋白 42，700 馬心肌球蛋白 16，900 牛血清白蛋白 66，200 醛縮酶 40，000 溶菌酶 14，400 過氧化氫酶` 57，000 碳酸酐酶 31，000 肌球蛋白（F1） 8，100 醛縮酶 40，000 大豆脻蛋白酶 21，500 肌球蛋白（F2） 6，200 抑制劑 肌球蛋白（F3） 2，500 溶菌酶 14，400 5．常用DNA分子量標準參照物 λDNA/HindⅢ λDNA/EcoRⅠ λ/HindⅢ+EcoRⅠ pBR322/HaeⅢ 23130 21226 21227 587 123 9416 7421 5148 405 104 6557 5804 4973 504 89 4361 5643 4268 458 80 2322 4843 3530 434 64 2027 3530 2027 267 57 564 1904 234 51 125 1584 213 21 1375 192 18 974 184 11 831 124 7 564 125 續上表 pBR322/HinfⅠ φχ174/HinfⅠ φχ174/Hae Ⅲ φχ174/TapⅠ 1631 726 140 1353 2914 517 713 118 1078 1175 506 553 100 872 404 396 500 82 603 327 344 417 66 310 231 298 413 48 281 141 221 311 42 271 87 220 249 40 234 54 154 200 24 194 33 75 151 118 20 72 二、常用緩衝液 1．分子克隆常用緩衝液 2．磷酸緩衝液 （1）25℃下0.1mol/L磷酸鉀緩衝液的配製※ pH 1mol/L K2HPO4(ml) 1mol/L KH2PO4(ml) 5.8 8.5 91.5 6.0 13.2 86.8 6.2 19.2 80.8 6.4 27.8 72.2 6.6 38.1 61.9 6.8 49.7 50.3 7.0 61.5 38.5 7.2 71.7 28.3 7.4 80.2 19.8 7.6 86.6 13.4 7.8 90.8 9.2 8.0 94.0 6.2 （2）25℃下0.1mol/L磷酸鈉緩衝液的配製※ pH 1mol/L Na2HPO4(ml) 1mol/L NaH2PO4(ml) 5.8 7.9 92.1 6.0 12.0 88.0 6.2 17.8 82.2 6.4 25.5 74.5 6.6 35.2 64.8 6.8 46.3 53.7 7.0 57.7 42.3 7.2 68.4 31.6 7.4 77.4 22.6 7.6 84.5 15.5 7.8 89.6 10.4 8.0 93.2 6.8 ※:用蒸餾水將混合的兩種1mol/L貯存液稀釋至1000ml，根據Henderson-Hasselbalch方程計算其pH值： pH=pK』+1g([質子受體]/[質子供體]) 在此，pK』=6.86(25℃)。 3．電泳緩衝液 測序凝膠加樣緩衝液 98%去離子甲醯胺 10mol/L EDTA(pH8.0) 0.025%二甲苯青FF 0.025%溴酚藍 甲醯胺：許多批號的試劑級甲醯胺，其純度符合使用要求，無須再進行處理。不過，一旦略呈黃色，則應用在磁力攪拌器上將甲醯胺與Dowex XG8混合床樹脂共同攪拌1小時進行去離子處理，並用Whatman 1號濾紙過濾2次，去離子甲醯胺分裝成小份，充氮存於-70℃。 常用的電泳緩衝液 緩衝液 使用液 濃貯存液（每升） Tris-乙酸（TAE） 1×：0.04mol/L Tris-乙酸 50×：242g Tris鹼 0.001mol/L EDTA 57.1ml冰乙酸 100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-磷酸（TPE） 1×:0.09mol/L Tris-磷酸 10×:10g Tris鹼 0.002mol/L EDTA 15.5ml85%磷酸（1.679g/ml） 40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-硼酸（TBE）a 0.5×0.045mol/L Tris-硼酸 5×：54g Tris鹼 0.001mol/L EDTA 27.5硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 鹼性緩衝液b 1×:50mmol/L NaOH 1×:5ml 10mol/L NaOH 1mmol/L EDTA 2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0) Tris-甘氨酸c 1×:25mmol/L Tris 5×:15.1g Tris 250mmol/L 甘氨酸 94g 苷氨酸（電泳級）（pH8.3） 0.1% SDS 50ml 10% SDS(電泳級) 說明： ①TBE溶液長時間存放後會形成沉澱物，為避免這一問題，可在室溫下用玻璃瓶保存5×溶液，出現沉澱後則予以廢棄。 以片都以1×TBE作為使用液（即1：5稀釋濃貯液）進行瓊脂糖凝膠電泳。但0.5×的使用液已具備足夠的緩衝容量。目前幾乎所有的瓊脂糖膠電泳都以1：10稀釋的貯存液作為使用液。 進行聚丙烯醯胺凝膠垂直槽的緩衝液槽較小， 故通過緩衝液的電流量通常較大，需要使用1×TBE以提供足夠的緩衝容量。 ②鹼性電泳緩衝液應現用現配。 ③Tris-甘氨酸緩衝液用SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳。 2×SDS凝膠加樣緩衝液： 100mmol/L Tris·HCl(6.8) 200mmol/L二硫蘇糖醇（DTT） 4%SDS（電泳級） 0.2%溴酚藍 20%甘油 不含DTT的2×SDS凝膠加樣緩衝液可保存於室溫，應在臨用前取1mol/L貯存液現加於上述緩衝液中。 4．凝膠加樣緩衝液 緩衝液類型 6×緩衝液 貯存溫度 Ⅰ 0.25%溴酚藍 4℃ 0.25%二甲苯青FF 40%（W/V）蔗糖水溶液 Ⅱ 0.25溴酚藍 室溫 0.25%二甲苯青FF 15%聚蔗糖(Ficoll400) Ⅲ 0.25%溴酚藍 4℃ 0.25%二甲苯青FF 30%甘油水溶液 Ⅳ 0.25%溴酚藍 4℃ 40%(W/V)蔗糖水溶液 鹼性加樣緩衝液: 300mmol/L NaOH 6mmol/L EDTA Ⅴ 18%聚蔗糖(Ficoll400) 4℃ 0.15%溴甲酚綠 0.25%二甲苯青FF 使用以上凝膠加樣緩衝液的目的有三：增大樣品密度；以確保DNA均勻進入樣品孔內；使樣品呈現顏色，從而使加樣*作更為便利，含有在電塊中能以可預知速率向陽極泳動的染料。溴酚藍在瓊脂糖中移動的速率約為二甲苯青FF的2.2倍，而與瓊脂糖濃度無關。以0.5×TBF作電泳液時，溴酚藍在瓊脂糖中的泳動速率約與長300bp的雙鏈線狀DNA相同，而二甲苯青FF的泳動則與長4kb的雙鏈線狀DNA相同。在瓊脂糖濃度為0.5%～1.4%的範圍內，這些對應關係受凝膠濃度變化的影響並不顯著。 選用哪一種加樣染料純屬個人喜惡。但是，對於鹼性凝膠應當使用溴甲酚綠作為示蹤染料，因為在鹼性pH條件下其顯色較溴酚更藍為鮮明。 5．各種pH值的Tris緩衝液的配製 各種pH值的Tris緩衝液的配製 所需pH值（25℃） 0.1mol/L HCl的體積 7．1 45．7 7．2 44．7 7．3 43．4 7．4 42．0 7．5 40．3 7．6 38．5 7．7 36．6 7．8 34．5 7．9 32．0 8．0 29．2 8.1 26.2 8.2 22.9 8.3 19.9 8.4 17.2 8.5 14.7 8.6 12.4 8.7 10.3 8.8 8.5 8.9 7.0 某一特定pH值的0.05mol/L Tris緩衝液的配製：將50ml 0.1mol/L Tris鹼溶液與上表所示相應體積（單位：ml）的0.1ml/L HCl混合，加水將體積調至100ml （2）溫度對50mmol/L Tris·HCl液pH值的影響 4℃ 25℃ 37℃ 8．1 7．5 7．2 8．2 7．6 7．3 8．3 7．7 7．4 8．4 7．8 7．5 8．5 7．9 7．6 8．6 8．0 7．7 8．7 8．1 7．8 8．8 8．2 7．9 8．9 8．3 8．0 9．0 8．4 8．1 9．1 8．5 8．2 9．2 8．6 8．3 9．3 8．7 8．4 9．4 8．8 8．5 （6）常用緩衝液的pKa值 緩衝液 分子量 pKa值 緩衝範圍 Trisa 12.1 8.08 7.1～7.9 HEPESb 283.3 7.47 7.2～8.2 MPOSc 209.3 7.15 6.6～7.8 PIPESd 304.3 6.76 6.2～7.3 MESe 195.2 6.09 5.4～6.8 a：三羥甲基氨基甲烷；b：N-2-羥乙基哌嗪-N』-2-乙磷酸；c：3-（N-嗎啉代）丙磺酸；d：N，N』-雙（2-乙磺酸）哌嗪；e：2-（N-嗎啉代）乙磺酸。 7．溫度對常用緩衝液pH的影響 緩衝體系 pKa(20℃) △pKa/10℃ Mes 6.15 -0.110 Ada 6.60 -0.110 PiPes 6.80 -0.085 Aces 6.90 -0.200 Bes 7.15 -0.160 Mops 7.20 -0.013 Tes 7.50 -0.200 Hepes 7.55 -0.014 Tricine 8.15 -0.210 Tris 8.30 -0.310 Bicine 8.35 -0.180 Glycylglycine 8.40 -0.280 三、常用酶的配製 1．溶菌酶 用水配製成50mg/ml的溶菌酶溶液，分裝成小份並保存於-20℃。每一小份一經使用後便予丟棄。 2．蛋白水解酶類 貯存液 貯存溫度 反應濃度 反應緩衝液 溫度 預處理 0.01mol/L Tris(pH7.8) 鏈黴蛋白酶a 20mg/ml -20℃（溶於水） 1mg/ml 0.01mol/L EDTA 37℃ 自消化b 0.5% SDS 0.01mol/L Tris(pH7.8) 蛋白酶Kc 20mg/ml -20℃（溶於水） 50μg/ml 0.005mol/L EDTA 37～56℃ 無須預處理 0.5% SDS a：鏈黴蛋白酶是從鏈球菌（Streptomyces griseus）中分離到的一種絲氨酸酶和酸性蛋白酶的混合物。 b：自消化可消除DNA酶和RNA酶的汙染，經自消化的鏈酶蛋白酶的配製方法如下：把該酶的粉末溶解於10mmol./l Tris·HCl(pH7.5)、10mmol/l NaCl中，配成20mg/ml濃度，於37℃溫育1h。經消化的鏈黴蛋白酶分裝成小份放在密封試管中，保存-20℃。 c：蛋白酶K是一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶，從林伯氏白色念球菌（Tritirachium album Limber）中純化得到。該酶有兩個Ca2+結合位點，它們離酶的活性中心有一定距離，與催化機理並無直接關係。然而，如果從該酶中除去Ca2+，由於出現遠程的結構變化，催化活性將喪失80%左右，但其剩餘活性通常已足以降解在一般情況下汙染酸製品的蛋白質。所以，蛋白酶K消化過程中通常加入EDTA（以抑制依賴於Mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化對蛋白酶K具有較強耐性的蛋白，如角蛋白一類，則可能需要使用含有1mmol/l Ca2+而不含EDTA的緩衝液。在消化完畢後、純化核酸前要加入EGT（pH8.0）至終濃度為2mmol/L,以鰲合Ca2+。 3．無DNA酶的RNA酶 將胰RNA酶（RNA酶A）溶於10mmol/l Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/l NaCl中，配成10mg/ml的濃度，於100℃加熱15min，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存於-20℃。 四、常用抗生素溶液 抗生素 貯存液a 工作濃度 濃度 保存條件 嚴緊型質粒 鬆弛型質粒 氨苄青黴素 50mg/ml(溶於水) -20℃ 20μg/ml 60μg/ml 羧苄青黴素 50mg/ml(溶於水) -20℃ 20μg/ml 60μg/ml 氯黴素 34mg/ml(溶於乙醇) -20℃ 25μg/ml 170μg/ml 卡那黴素 10mg/ml(溶於水) -20℃ 10μg/ml 50μg/ml 鏈黴素 10mg/ml(溶於水) -20℃ 10μg/ml 50μg/ml 四環素b 5mg/ml(溶於乙醇) -20℃ 10μg/ml 50μg/ml a：以水為溶劑的抗生素貯存液通過0.22μm濾器過濾除菌。以乙醇為溶劑的抗生素溶液無須除菌處理。所有抗生素溶液均應放於不透光的容器保存。 b：鎂離子是四環素的拮抗劑，四環素抗性菌的篩選應使用不含鎂鹽的培養基（如LB培養基）。 五、常用貯存液的配製 1．30%丙烯醯胺溶液 【配製方法】 將29g丙烯醯胺和1g N，N』-亞甲雙丙烯醯胺溶於總體積為60ml的水中。加熱至37℃溶解之，補加水至終體積為100ml。用Nalgene濾器（0.45μm孔徑）過濾除菌，查證該溶液的pH值應不大於7.0，置棕色瓶中保存於室溫。 【注意】 丙烯醯胺具有很強的神經毒性並可以通過皮膚吸收，其作用具累積性。稱量丙烯醯胺和亞甲雙丙烯醯胺時應戴手套和面具。可認為聚丙烯醯胺無毒，但也應謹慎*作，因為它還可能會含有少量未聚合材料。 一些價格較低的丙烯醯胺和雙丙烯醯胺通常含有一些金屬離子，在丙烯醯胺貯存液中加入大約0.2體積的單床混合樹脂（MB-1Mallinckrodt），攪拌過夜，然後用Whatman 1號濾紙過濾以純化之。 在貯存期間，丙烯醯胺和雙丙烯醯胺會緩慢轉化成丙烯醯和雙丙烯酸。 2．40%丙烯醯胺 【配製方法】 把380g丙烯醯胺（DNA測序級）和20g N，N』-亞甲雙丙烯醯胺溶於總體積為600ml的蒸餾水中。繼續按上述配製30%丙烯醯胺溶液的方法處理，但加熱溶解後應以蒸餾水補足至終體積為1L。 【注意】 見上述配製30%丙烯醯胺的說明，40%丙烯醯胺溶液用於DNA序列測定。 3．放線菌素D溶液 【配製方法】 把20mg放線菌素D溶解於4ml 100%乙醇中，1：10稀釋貯存液，用100%乙醇作空白對照讀取OD440值。放線菌素D（分子量為1255）純品在水溶液中的摩爾消化係數為21，900，故而1mg/ml的放線菌素D溶液在440nm處的吸光值為0.182，放線菌素D的貯存液應放在包有箔片的試管中，保存於-20℃。 【注意】 放線菌素D是致畸劑和致癌劑，配製該溶液時必須戴手套並在通風櫥內*作，而不能在開放在實驗桌面上進行，謹防吸入藥粉或讓其接觸到眼睛或皮膚。 藥廠提供的作治療用途的放線菌素D製品常含有糖或鹽等添加劑。只要通過測量貯存液在440nm波長處的光吸收確定放線菌素D的濃度，這類製品便可用於抑制自身引導作用。 4．0.1mol/L腺苷三磷酸（ATP）溶液 【配製方法】 在0.8ml水中溶解60mg ATP,用0.1mol/L NaOH調至pH值至7.0，用蒸餾水定容1ml，分裝成小份保存於-70℃ 5．10mol/L乙酸醯溶液 【配製方法】 把770g乙酸醯溶解於800ml水中，加水定容至1L後過濾除菌。 6．10%過硫酸銨溶液 【配製方法】 把1g過硫酸銨溶解於終量為10ml的水溶液中，該溶液可在4℃保存數周。 7．BCIP溶液 【配製方法】 把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二鈉鹽（BCIP）溶解於10ml 100%的二甲基甲醯胺中，保存於4℃ 8．2×BES緩衝鹽溶液 【配製方法】 用總體積90ml的蒸餾水溶解1.07g鹽溶液BES[N，N-雙（2-羥乙基）-2-氨基乙磺酸]、1.6g NaCl和0.027g Na2HPO4，室溫下用HCl調節 該溶液的pH值至6.96、然後加入蒸餾水定容至100ml，用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成小份，保存於-20℃。 9．1mol/L CaCl2溶液 【配製方法】 在200ml蒸餾水中溶解54g CaCl2·6H2O，用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成10ml小份貯存於-20℃。 【注意】 製備感受態細胞時，取出一小份解凍並用蒸餾水稀釋至100ml，用Nalgene濾器（0.45μm孔徑）過濾除菌，然後驟冷至0℃。 10．2.5mol/L CaCl2溶液 【配製方法】 在20ml蒸餾水中溶解13.5g CaCl2·6H2O，用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成1ml小份貯存於-20℃。 11．1mol/L二硫蘇糖醇（DTT）溶液 【配製方法】 用20ml 0.01mol/L乙酸鈉溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT，過濾除菌後分裝成1ml小份貯存於-20℃。 【注意】 DTT或含有DTT的溶液不能進行高壓處理。 12．脫氧核苷三磷酸（dNTP）溶液 【配製方法】 把每一種dNTP溶解於水至濃度各為100mmol/L左右，用微量移液器吸取0.05mol/l Tris鹼分別調節 每一dNTP溶液的pH值7.0（用pH試紙檢測），把中和後的每種dNTP溶液各取一份作適當稀釋，在下表中給出的波長下讀取光密度計算出每種dNTP的實際濃度，然後用水稀釋成終濃度為50mmol/L的dNTP，分裝成小份貯存於-70℃。 鹼基 波長（nm） 消化係數（ε）[L/（mol·cm）] A 259 1.54×104 G 253 1.37×104 C 271 9.10×103 T 260 7.40×103 比色杯光徑為1cm時,吸光度=εM 13．0.5mol/l EDTA(pH8.0)溶液 【配製方法】 在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na·2H2O），在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調節 溶液的pH值至8.0（約需20g NaOH顆粒）然後定容至1L，分裝後高壓滅菌備用。 【注意】 EDTA二鈉鹽需加入NaOH將溶液的pH值調至接近8.0，才能完全溶解。 14．溴化乙錠（10mg/ml溶液） 【配製方法】 在100ml水中加入1g溴化乙錠，磁力攪拌數小時以確保其完全溶解，然後用鋁箔包裹容器或轉移至棕色瓶中，保存於室溫。 【注意】 小心：溴化乙錠是強誘變劑並有中度毒性，使用含有這種染料的溶液時務必戴上手套，稱量染料時要戴面罩。 15．2×HEPES緩衝鹽溶液 【配製方法】 用總量為90ml的蒸餾水溶解1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027g Na2PO4·2H2O、0.2g葡聚糖和1gHEPES，用0.5mol/l NaOH調節 pH值至7.05，再用蒸餾水定容至100ml。用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成5ml小份，貯存於-20℃。 16．IPTG溶液 【配製方法】 IPTG為異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（分子量為238.3），在8ml蒸餾水中溶解2g IPTG後，用蒸餾水定容至10ml，用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成1ml小份貯存於-20℃。 17．1mol/L乙酸鎂溶液 【配製方法】 在800ml水中溶解214.46g四水乙酸鎂，用水定容至1L過濾除菌。 18．1mol/L MgCl2溶液 【配製方法】 在800ml水中溶解203.4g MgCl2·6H2O，用水定容至1L，分裝成小份並高壓滅菌備用。 【注意】 MgCl2極易潮解，應選購小瓶（如100g）試劑，啟用新瓶後勿長期存放。 19．β-巰基乙醇（BME）溶液 【配製方法】 一般得到的是14.4mol/L溶液，應裝在棕色瓶中保存於4℃。 【注意】 BME或含有BME的溶液不能高壓處理。 20．NBT溶液 【配製方法】 把0.5g氯化氮藍四唑溶解於10ml 70%的二甲基甲醯胺中，保存於4℃。 21．酚/氯仿溶液 【配製方法】 把酚和氯仿等體積混合後用0.1mol/L Tris·HCl(pH7.6)抽提幾次以平衡這一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆蓋等體積的0.01mol/l Tris·HCl(pH7.6)液層，保存於4℃。 【注意】 酚腐蝕性很強，並可引起嚴重灼傷，*作時應戴手套及防護鏡，穿防護服。所有*作均應在化學通風櫥中進行。與酚接觸過的部位皮膚應用大量的水清洗，並用肥皂和水洗滌，忌用乙醇。 22．10mmol/L苯甲基磺醯氟（PMSF）溶液 【配製方法】 用異丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml（10mmol/L），分裝成小份貯存於-20℃。如有必要可配成濃度高達17.4mg/ml的貯存液（100mmol/L）。 【注意】 PMSF嚴重損害呼吸道黏膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進或通過皮膚吸收後有致命危險。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF，應立即用大量水衝洗之。凡被PMSF汙染的衣物應予丟棄。 PMSF在水溶液中不穩定。應在使用前從貯存液中現用現加於裂解緩衝液中。PMSF在水溶液中的活性喪失速率隨pH值的升高而加快，且25℃的失活速率高於4℃。pH值為8.0時，20μmmol/l PMSF水溶液的半壽期大約為85min，這表明將PMSF溶液調節 為鹼性（pH>8.6）並在室溫放置數小時後，可安全地予以丟棄。 23．磷酸鹽緩衝溶液（PBS）溶液 【配製方法】 在800ml蒸餾水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,用HCl調節 溶液的pH值至7.4加水定容至1L，在15lbf/in2(1034×105Pa)高壓下蒸氣滅菌20min。保存於室溫。 24．1mol/L乙酸鉀（pH7.5）溶液 【配製方法】 將9.82g乙酸鉀溶解於90ml純水中，用2mol/L乙酸調節 pH值至7.5後加入純水定容到1L，保存於-20℃。 25．乙酸鉀溶液（用於鹼裂解） 【配製方法】 在60ml 5mol/L乙酸鉀溶液中加入11.5ml冰乙酸和28.5ml水，即成鉀濃度為3mol/L而乙酸根濃度為5mol/L的溶液。 26．3mol/L乙酸鈉（pH5.2和pH7.0）溶液 【配製方法】 在80ml水中溶解408.1g三水乙酸鈉，用冰乙酸調節 pH值至5.2或用稀乙酸調節 pH值至7.0，加水定容到1L，分裝後高壓滅菌。 27．5mol/L NaCl溶液 【配製方法】 在800ml水中溶解292.2g NaCl加水定容至1L，分裝後高壓滅菌。 28．10%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液 【配製方法】 在900ml水中溶解100g電泳級SDS，加熱至68℃助溶，加入幾滴濃鹽酸調節 溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分裝備用。 【注意】 SDS的微細晶粒易擴散，因此稱量時要戴面罩，稱量完畢後要清除殘留在稱量工作區和天平上的SDS，10%SDS溶液無須滅菌。 29．20×SSC溶液 【配製方法】 在800ml水中溶解175.3g NaCl和88.2g檸檬酸鈉，加入數滴10mol/l NaOH溶液調節 pH值至7.0，加水定容至1L，分裝後高壓滅菌。 30．20×SSPE溶液 【配製方法】 在800ml水中溶解17.5g NaCl、27.6g NaH2PO4·H2O和7.4g EDTA，用NaOH溶液調節 pH值至7.4（約需6.5ml 10ml/L NaOH），加水定容至1L，分裝後高壓滅菌。 31．100%三氯乙酸溶液 【配製方法】 在裝有500g TCA的瓶中加入227ml水，形成的溶液含有100%（M/V）TCA。 32．1mol/L Tris溶液 【配製方法】 在800ml水中溶解121.91g Tris鹼，加入濃HCl調節 pH值至所需值。 pH HCl 7.4 70ml 7.6 60ml 8.0 42ml 應使溶液冷至室溫後方可最後調定pH值，加水定容至1L，分裝後高壓滅菌。 【注意】 如1mol/L溶液呈現黃色，應予丟棄並置備質量更好的Tris。 儘管多種類型的電極均不能準確測量Tris溶液的pH值，但仍可向大多數廠商購得合適的電極。 Tris溶液的pH值因溫度而異，溫度每升高1℃，pH值大約降低0.03個單位。例如：0.05mol/L的溶液在5℃、25℃、和37℃時的pH值分別為9.5、8.9和8.6。 33．Tris緩衝鹽溶液（TBS）（25mmol/l Tris） 【配製方法】 在800ml蒸餾水中溶解8g NaCl、0.2g KCl和3g Tris鹼，加入0.015g酚並用HCl調至pH值至7.4，用蒸餾水定容至1L，分裝後在151bf/in2(1.034×105Pa)高壓下蒸汽滅菌20min，於室溫保存。 34．X-gal溶液 【配製方法】 X-gal為5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。用二基甲醯胺溶解X-gal配製成的20mg/ml的貯存液。保存於一玻璃管或聚丙烯管中，裝有X-gal溶液的試管須用鋁箔封裹以防因受光照而被破壞，並應貯存於-20℃。X-gal溶液無須過濾除菌。 雜交試驗中用於降低背景的封閉劑 試劑 用途 Denhardt試劑 Northern雜交 使用RNA探針的雜交 單拷貝序列的Southern雜交 將DNA固定於尼龍膜上的雜交 Denhardt試劑通常配製50×貯存液，過濾後保存於-20℃。可將該貯存液10倍稀釋於預雜交液（常為含有0.5%SDS和100μg/ml經變性被打斷的鮭精DNA的6×SSC或6×SSPE）中。50×Denhardt液中含5g聚蔗糖（Ficoll,400型，Pharmacia）、5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白（組分V」Sigmal），加水至終體積為500ml。 BLOTTO Grunstein-Hogness雜交 Benton-Davis雜交 除單拷貝序列Southern雜交以外的所有Southern雜交 斑點印跡 1×BLOTT（牛乳轉移技術優化液，Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer）,是含5%膠脂奶粉和0.02%疊氮鈉的水溶液，應保存於4℃。使用前可用預雜交液稀釋25倍。BLOTTO不應與高濃度的SDS並用，因為後者會導致牛奶中蛋白質析出。如果雜交背景不合要求，可在雜交液中加入NP-40至終濃度為1%。BLOTTO不能用作Northern雜交的封閉劑，因為這一封閉劑中可能含有RNA酶，其活性之高使人無法接受。 注意：疊氮鈉有毒性，取用時需戴手套小心*作。含疊氮鈉的溶液應予明確標記。 肝素 Southern雜交 原位雜交 肝素（Sigma H-7005，從豬中提取的二級產品或相當等級的產品）用4×SSPE或4×SSC溶解配製成50mg/ml的濃度，保存於4℃。肝素在含有葡聚糖硫酸酯的雜交液中用作封閉劑的濃度為500μg/ml，在不含葡聚糖硫酸酯的雜交液中的濃度為50μg/ml。 經變性並被打斷的鮭精DNA southern和Northern雜交 把鮭魚精子DNA（Sigma,Ⅲ,鹽鈉）溶解於水配製成10mg/ml的濃度，必要時於室溫磁力攪拌2～4h助溶。把溶液中NaCl的濃度調至0.1mol/L，並用酚和酚/氯仿各抽提一次，回收水相。合DNA溶液快速通17號皮下注射針頭12次，以剪切DNA。加入2倍體積用冰預冷的乙醇沉澱DNA。離心回收DNA並重溶於水，配製成10mg/ml的濃度，測定溶液的OD260值並計算出精確的DNA濃度，然後煮沸10min，分裝成小份保存於-20℃。使用前置沸水浴中加熱5min，然後迅速在冰浴中驟冷。預雜交液中應含有100μg/ml經變性並被打斷的鮭魚精子DNA 六、常用凝膠的技術參數 1．葡聚糖凝膠的某些技術數據 種類 幹顆粒直徑（μ） 分子量分級範圍 床體積毫升/克幹分子篩 得水值 溶脹最少平衡時間（h） 柱頭壓力（kPa）(2.5cm直徑柱) 肽及球形蛋白質 葡聚糖（線性分子） 室溫 沸水浴 Sephadex G-10 40～ 120 ～700 ～700 2～ 3 1.0±0.1 3 1 Sephadex G-10 40～ 120 ～1500 1500 2.5～3.5 1.5±3.5 3 1 Sephadex G-25 粗級 100～300 (≈5～100目) 中級 50～150 (≈100～200目) 1,000～ 5,000 100～ 5,000 4～6 1.5±0.2 6 2 細級 20～800(≈200～400目) 超細 10～40 Sephadex G-50 粗級 100～200 中級 50～150 1,500～ 500～ 細級 20～80 30,000 10,000 9～11 5.0±0.3 6 2 超細 10～40 Sephadex G-75 40～120 3,000～ 1,000～ 超細 10～40 70,000 950,000 12～15 7.5±0.5 24 3 3.92～15.86 Sephadex G-100 40～120 4,000～ 1,000～ 超細 10～40 1,500,000 150,000 15～20 10.0±1.0 48 5 2.35～9.41 Sephadex G-150 40～120 5,000～ 1,000～ 20～30 超細 10～40 400,000 150,000 18～22 15.0±1.5 72 5 0.88～3.53 Sephadex G-200 40～120 5000～ 1000～ 30～40 10～40 800,000 200,000 20～25 20.0±2.0 72 5 0.39～1.57 2.聚丙烯醯胺凝膠的技術數據 型號 排阻的下限 (分子量) 分級分離範圍 (分子量) 膨脹後的床體積(ml/g幹凝膠) 膨脹所需最少時間(室溫,h) Bio-gel-P-2 1,600 200～2,000 3.8 2～4 Bio-gel-P-4 3,600 500～4,000 5.8 2～4 Bio-gel-P-6 4,600 1,000～5,000 8.8 2～4 Bio-gel-P-10 10,000 5,000～17,000 12.4 2～4 Bio-gel-P-30 30,000 20,000～50,000 14.9 10～12 Bio-gel-P-60 60,000 30,000～70,000 19.0 10～12 Bio-gel-P-100 100,000 40,000～100,000 19.0 24 Bio-gel-P-150 150,000 50,000~150,000 24.0 24 Bio-gel-P-200 200,000 80,000～200,000 34.0 48 Bio-gel-P-300 300,000 100～400,000 40.0 48 3．瓊脂糖凝膠的技術數據 型號 瓊脂糖含量 %（W/W） 排阻的下限 （分子量） 分級分離的範圍（分子量） 生產廠家 Sepharose 4B 4 0.3×106～3×106 Pharmacia Sepharose 2B 2 2×106～25×106 Sagavac 10 10 2.5×105 1×104～2.5×105 Seravac Sagavac 8 8 7×105 2.5×104～7×105 Sagavac 6 6 2×106 5×104～2×106 Sagavac 4 4 15×106 2×105～15×106 Sagavac 2 2 150×106 5×105～15×107 Bio-gel A-0.5M 10 0.5×106 <1×104～0.5×106 Bio-Rad Bio-gel A-1.5M 8 1.5×106 <1×104～1.5×106 Bio-gel A-5M 6 5×106 1×104～5×106 Bio-gel A-15M 4 15×106 4×104～15×106 Bio-gel A-50M 2 50×106 1×105～50×106 Bio-gel A-150M 1 150×106 1×106～150×106 4．各處凝膠所允許的最大*作壓 凝膠 最大靜水壓（kPa） Sephadex G-10 9.8 G-15 9.8 G-25 9.8 G-50 9.8 G-75 4.9 5．瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA分辨範圍 凝膠濃度（%） 線性DNA長度（bp） 0.5 1000～30000 0.7 800～12000 1.0 500～10000 1.2 400～7000 1.5 200～3000 2.0 50～2000 6．染料在變性聚丙烯醯胺凝膠中的遷移速度 凝膠濃度（%） 溴酚藍 二甲苯青FF 5．0 35bp 140bp 6．0 26bp 106bp 8．0 19bp 75bp 10．0 12bp 55bp 20．0 8bp 28bp 7．染料在非變性聚丙烯醯胺凝膠中的遷移速度 凝膠濃度（%） 溴酚藍 二甲苯青FF 3.5 100bp 460bp 5.0 65bp 260bp 8.0 45bp 160bp 12.0 20bp 70bp 15.0 15bp 50bp 20.0 12bp 45bp 七、胺基酸的特性 胺基酸名稱 三字母縮寫 單字母縮寫 質量 側鏈電離的pHa值 結構式 丙氨酸（alanine） Ala A 89.09 精氨酸（arginine） Arg R 174.2 12.48 天冬醯氨（asparagine） Asn N 132.1 天冬氨酸（aspartic acid） Asp D 133.1 3.86 半胱氨酸（systeine） Cys C 121.12 穀氨醯胺（glutamine） Gln Q 146.15 穀氨酸（glutamic acid） Glu E 147.13 4.25 甘氨酸（glycine） Gly G 75.07 組氨酸（histidine） His H 155.16 6.0 異亮氨酸（isoleucine） lle I 131.17 亮氨酸（leucine） Leu L 131.17 賴氨酸（lycine） Lys K 146.19 甲硫氨酸（methionine） Met M 149.21 苯丙氨酸（phenylanaline） Phe P 165.19 脯氨酸（proline） Pro P 115.13 絲氨酸（serine） Ser S 105.06 蘇氨酸(threonine) Thr T 119.12 色氨酸（tryptophan） Trp W 204.22 酪氨酸（tyrosine） Tyr Y 181.19 10.07 纈氨酸（valine） Val P 117.15 八、遺傳密碼 密碼子的第二位 密碼子的第一位（5』端） U C A G 密碼子的第三位（3端』） U UUU Phe UCU Ser UAU Tyr UGU Gys U UUC Phe UCC Ser UAC Tyr UGG Gys C UUA Leu UCA Ser UAA 終止（赭石） UGA 終止（乳白） A UUG Leu UGG Ser UAG 終止（琥珀） UGG Trp G C CUU Leu CCU Pro CAU His CGA Arg U CUC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg C CUA Leu CCA Pro CAA Gln CGA Arg A CUG Leu CCG Pro CAG Gln CGC Arg G A AUU Ile ACU Thr AAU Asn AGU Ser U AUC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser C AUA Ile ACA Thr AAA Lys AGA Arg A AUG Met ACG Thr AAG Lys AGC Arg G G GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly U GUC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gly C GUA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gly A GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly G 九、常用酸鹼技術參數 1．常見的市售酸鹼的濃度 溶質 分子式 分子量 mol/L g/L 重量（%） 比重 配製mol/L溶液的加入量（ml/L） 冰乙酸 CH3COOH 60.05 17.40 1045 99.5 1.050 57.5 乙酸 60.05 6.27 376 36 1.045 159.5 甲酸 HCOOH 46.02 23.40 1080 90 1.200 42.7 鹽酸 HCl 36.50 11.60 424 36 1.180 86.2 2.90 105 10 1.050 344.8 硝酸 HNO3 63.02 15.99 1008 71 1.420 62.5 14.90 938 67 1.400 67.1 13.30 837 61 1.370 75.2 高氯酸 HclO3 100.50 11.65 1172 70 1.670 85.8 9.20 923 60 1.540 108.7 磷酸 H2PO4 80.00 18.10 1445 85 1.700 55.2 硫酸 H2P｀O4 98.10 18.00 1776 96 1.840 55.6 氫氧化銨 NH4OH 35.00 14.80 251 28 0.898 67.6 氫氧化鉀 KOH 56.10 13.50 757 50 1.520 74.1 1.94 109 10 1.090 515.5 氫氧化鈉 NaOH 40.00 19.10 763 50 1.530 52.4 2.75 111 10 1.110 363.4 2．各種濃度的酸鹼貯存液的近似pH值 溶質 1Na 0.1Na 0.01Na 0.001Na 乙酸 0.40 2.90 3.40 3.90 鹽酸 0.10 1.07 2.02 3.01 硫酸 0.30 1.20 2.10 檸檬酸 2.10 2.60 氫氧化銨 11.80 11.30 10.80 10.30 氫氧化鈉 14.05 13.07 12.12 11.13 碳酸氫鈉 8.40 碳酸鈉 11.50 11.00 J a.N為光量濃度[1N≈（1mol/L）×離子價數]。 |