The Scientist:從晶片到RNA-seq的轉型之路

自二十世紀九十年代中期以來，晶片就一直是基因組表達分析的中堅力量。在這一技術最輝煌的時期，準備研究基因表達模式的人都會想到使用晶片。不過隨著測序成本的直線下降，RNA測序（RNA-seq）成為了越來越受歡迎的轉錄組分析方法。

DNA晶片上排列著大量的核酸探針，可以代表生物的整個基因組或部分基因組，比如外顯子、miRNA、單核苷酸多態性SNP等等。用晶片分析基因表達需要抽提RNA，將其反轉錄為cDNA，然後進行螢光標記。晶片上各點的信號強弱，代表了該探針目的基因的表達量。

RNA-seq主要是將RNA轉化為cDNA文庫，然後進行直接測序。雖然處理原始數據比較麻煩，但RNA-seq能夠做得到晶片做不到的事。RNA-seq可以揭示未知的轉錄本、基因融合和遺傳多態性，而晶片只能檢出明確的已知目標。在測序深度足夠的情況下，RNA-seq在高豐度和低豐度轉錄本檢測中都比晶片有效。

不過由於晶片可以快速分析大量樣本，該技術在這方面還將繼續佔據統治地位，FDA國家毒理學研究中心的Weida Tong指出。不過，科學研究最終將完全轉向RNA-seq，Tong說。在此之前，晶片和RNA-seq數據應當更加兼容，RNA-seq數據的分析和儲存必須進一步簡化。「這就像是臨產前的陣痛期，」Tong說。「一旦完成這個痛苦的過程，大家就能真正享受到技術帶來的福利。」

The Scientist雜誌與多位專家共同探討了從晶片到RNA-seq的過渡，希望幫助研究者們順利度過這段艱難的轉型期，最終實現華麗轉身。

通向全新世界

晶片分析依賴於已知的基因組信息，這也是該技術的最大局限。顯然，在探索性研究和非模式生物研究中，RNA-seq才是真正的大贏家。RNA-seq的轉錄組分析是無偏好的，可以揭示新剪接點、小RNA以及晶片漏掉的新基因。

「與晶片探針不同，RNA測序不需要預先知道序列信息，」安捷倫科技公司的Kevin Poon說，「因此它是一個理想的研發平臺，能夠獲得轉錄本序列並在此基礎上發現突變和融合轉錄本。」

改用RNA-seq的研究者們往往是「看到了晶片無法檢出的生物學信息，」賽默飛世爾公司的Anup Parikh指出。舉例來說，南佛羅裡達大學（USF）Christina Richards實驗室的研究生Mariano Alvarez正在研究2010墨西哥灣漏油事件對當地植物的影響。他們最初是用晶片在評估基因表達，但現在他們已經引入了RNA測序數據，以獲得更為豐富的信息。

沒有底線的檢測

晶片檢測的動態範圍比較窄，在轉錄本豐度很低的情況下，RNA-seq才是你正確的選擇。Tong及其同事去年用Illumina RNA-seq平臺和Affymetrix晶片，評估了大鼠肝臟在藥物處理下的基因表達改變。他們發現，在檢測豐度較高的基因時，RNA-seq和晶片的結果基本一致。但在檢測表達水平低的基因時，RNA-seq更加準確。這一結論也得到了其他一些研究的支持。

造成這種差異的主要原因是，當基因低水平表達時，晶片中結合探針的cDNA發出較弱的螢光，難以壓倒背景螢光。對於RNA-seq而言，覆蓋度越高能檢測的轉錄本水平就越低，沒有絕對的下限。當然，RNA-seq也沒有絕對的檢測上限。而晶片在檢測表達量很高的基因時，可能會出現飽和。

生命力依然頑強

儘管RNA-seq有許多優勢，但許多研究者還是在繼續使用晶片，尤其是樣本量比較大的研究。晶片在臨床研究中也很吃香，因為它的數據處理又快又簡單。「晶片能提供高度一致的數據，分析軟體也相當成熟，」Poon說。「通過分析成百上千的樣本，基因和miRNA的表達特徵已經被賦予了臨床上的診斷價值。」

「我會一直使用晶片，」MitoGenetics公司的Kirk Mantione說。「我知道要做些什麼，結果也更容易解讀。」

Mantione使用晶片對自己開發的藥物進行評估，在細胞系和動物中分析這些藥物對基因表達的影響。晶片可以快速給出結果，展示藥物對特定基因的作用。不過Mantione也希望用RNA-seq研究那些還不成熟的生物模型，或者尋找之前沒有發現的轉錄本多態性。

有時候，人們繼續使用晶片只是因為想要對新數據和舊數據進行比較，如果所有的數據都是以同樣的方式獲得的，比較起來自然更為容易。

Affymetrix公司建議大家先用晶片快速篩查大量樣本，然後用這些結果指導RNA-seq。此外，晶片也可以用來驗證RNA-seq的數據。