獲獎論文特等獎：鳳丹牡丹鮮花原液清除DPPH自由基功效研究
毛文嶽1，孫春燕1，紀海鵬1, 鄭立波2 劉繼國3
（1天寶牡丹生物科技有限公司.山東菏澤274000
2北京日化協會化妝品功效評價專業技術會）
3菏澤市牡丹產業發展中心
【內容提要】
鳳丹牡丹（PaeoniaostiiT.HongetJ.X.Zhang）花及種子油均被國家批准為新食品原料，在相關文件中又稱油用牡丹；牡丹花水在中外化妝品原料目錄中均有記載。鳳丹牡丹鮮花花瓣可用不同工藝製備汁液，稱鮮花原液或鮮花純露。在採用DPPH法進行清除自由基實驗中，對於壓榨過濾法、蒸餾法製備的牡丹鮮花原液及市場購買的蒸餾法進口玫瑰純露進行了同步實驗，結果表明：壓榨過濾法製備的牡丹鮮花原液在工業化應用常用濃度1%-7%條件下清除DPPH自由基功效達到24.87-89.50%，該結果表明壓榨過濾法製備的牡丹鮮花原液優於其它方法和材料生產的鮮花純露類產品。
【關鍵詞】油用牡丹；鮮花原液；玫瑰純露；化妝品原料；抗自由基
【作者介紹】毛文嶽 主任中藥師 760341998@qq.com
1 實驗原理
DPPH (1，1-disphenyl-2-picry1-hydrazy1)，化學命名為1，1二苯基-2-三硝基苯肼，分子式為(C6H5)2N。-NC6H5(NO2)3此化合物中在氮橋的一個原子上有一個未成對的價電子，而此電子的軌道運動幾乎由分子結構所抵消，通常以捕獲DPPH自由基作為評定抗氧化能力的指標。DPPH是一種穩定的有機自由基，在可見光區最大吸收峰為517nm，在乙醇溶液中，每個DPPH分子在溶液中可生成一個穩定的含氮自由基，具有典型紫色，當它與提供1個電子的自由基清除劑作用時，生成無色產物，使溶液的典型紫色變淺。其褪色程度與配對電子數成化學計量關係。因而可用分光光度法進行定量分析，來檢測自由基清除情況，從而評價樣品的清除自由基的能力。
2 實驗儀器和試劑
2.1 儀器
酶標儀，5mL、10mL EP管，分析天平，移液槍，容量瓶。
2.2 樣品
壓榨過濾法製備的牡丹鮮花原液（實驗室編號YS16）；蒸餾法製備的牡丹鮮花原液(編號YS15)；購買的玫瑰鮮花純露(編號SS1)。
2.3 試劑
(1) DPPH 乙醇溶液的配置：準確稱取20mg的DPPH，加入無水乙醇溶解並定容於250mL容量瓶中，DPPH濃度配製為2×10-4mol/L；0-4℃ 下避光保存，現配現用，4h 內有效；
(2) 待測液的配置：待測液的濃度應在 10-4mol/L 數量級。
3實驗步驟
(1) 準確量取1mL的待測液與1mL的2×10-4mol/L 的 DPPH溶液混勻（A1管）；
(2) 準確量取1mL的無水乙醇與1mL的2×10-4mol/L 的DPPH溶液混勻（A2管）；
(3) 準確量取1mL的無水乙醇與1mL的待測液混勻（A3管）；
(4) 反應30min後，在517nm下測 A1、A2、A3管吸光度值。
表2 試劑配比表
編號
DPPH溶液
無水乙醇
待測液
總體積
A1
1.0mL
——
1.0mL
2mL
A2
1.0mL
1.0mL
——
2mL
A3
——
1.0mL
1.0mL
2mL
4 數據處理
清除率計算公式為： 清除率（%）=[（A2+A3）-A1]/A2
5 結果分析
5.1 樣品處理
5.1.1 玫瑰鮮花純露SS1
用移液槍分別準確量取0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、3.0mL、5.0mL、7.5mL測試液原液，加入去離子水稀釋定容至10mL，分別得到5%、10%、15%、20%、30%、50%、75%的測試液，記為實驗組1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7。另量取4mL測試液原液,不稀釋，濃度100%，記為實驗組1-8。
5.1.2 牡丹鮮花原液YS15
用移液槍分別準確量取0.1mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、5.0mL、7.5mL測試液原液，加入去離子水稀釋定容至10mL，得到1%、5%、10%、20%、30%、50%、75%的測試液，記為實驗組2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7；另用移液槍準確量取4.0mL測試液原液，得到100%的測試液，記為實驗組2-8。
5.1.3牡丹鮮花原液YS16
用移液槍分別準確量取0.05mL、0.1mL、0.3mL、0.5mL、0.7mL測試液原液，加入去離子水稀釋定容至10mL，得到0.5%、1%、3%、5%、7%的測試液，記為實驗組3-1、3-2、3-3、3-4、3-5；另用移液槍準確量取4.0mL測試液原液，得到100%的測試液，記為實驗組3-6；
用分析天平準確稱取10mgVc，加入去離子水稀釋定容至10mL，得到0.1%的測試液，記為陽性對照組；
用去離子水作為陰性對照，記為陰性對照組。
5.2 實驗結果
通過計算公式計算，可得每個樣品的清除率，見表2：
表3 玫瑰鮮花純露SS1的實驗結果
組別
實驗組1-1
實驗組1-2
實驗組1-3
實驗組1-4
實驗組1-5
實驗組1-6
實驗組1-7
實驗組1-8
濃度/%
5
10
15
20
30
50
75
100
抑制率/%
3.59
9.65
12.43
14.94
16.44
22.42
41.51
46.33
圖1 玫瑰鮮花純露SS1對DPPH·自由基清除率
由表3和圖1可以看出，隨著濃度的增加，測試樣品玫瑰鮮花純露SS1對DPPH自由基的清除率呈上升趨勢。陽性對照（0.1%的Vc）對DPPH自由基的清除率為91.44%，測試樣品原液（100%）對DPPH自由基的清除率為46.33%，相對陽性對照，測試樣品玫瑰鮮花純露SS1在生產實踐常用濃度5-10%條件下，對DPPH自由基清除率為5-18%範圍。
表4牡丹鮮花原液YS15的實驗結果
組別
實驗組2-1
實驗組2-2
實驗組2-3
實驗組2-4
實驗組2-5
實驗組2-6
實驗組2-7
實驗組2-8
濃度/%
1
5
10
20
30
50
75
100
抑制率/%
3.53
6.13
6.64
7.43
11.81
29.83
34.81
39.20
圖2 牡丹鮮花原液YS15對DPPH·自由基清除率
由表4和圖3可以看出，隨著濃度的增加，測試樣品牡丹鮮花原液YS15對DPPH自由基的清除率呈上升趨勢，且在50%濃度時，清除率有明顯的上升。陽性對照（0.1%的Vc）對DPPH自由基的清除率為91.44%，測試樣品原液（100%）對DPPH自由基的清除率為39.20%；相對陽性對照組，測試樣品牡丹鮮花原液YS15對DPPH自由基有一定的清除效果。
表5 牡丹鮮花原液YS16的實驗結果
組別
實驗組3-1
實驗組3-2
實驗組3-3
實驗組3-4
實驗組3-5
實驗組3-6
陰性
對照
陽性
對照
濃度/%
0.5
1
3
5
7
100
/
0.1
抑制率/%
16.93
24.87
48.63
73.75
89.50
-17.27
1.56
91.44
圖3 牡丹鮮花原液YS16對DPPH·自由基清除率
由表5和圖3可以看出，隨著濃度的增加，測試樣品牡丹鮮花原液YS16對DPPH自由基的清除率呈上升趨勢。陽性對照（0.1%的Vc）對DPPH自由基的清除率為91.44%，測試樣品牡丹鮮花原液YS16在濃度為7%時，對DPPH自由基的清除率為89.50%，與陽性對照的清除率處在同一水平。（測試樣品原液100%在加入含有無水乙醇的DPPH溶液後，出現渾濁現象，結果異常）。測試樣品牡丹鮮花原液YS16對DPPH自由基清除率的IC50值約為3.2%，說明測試樣品濃度與抑制率呈拋物線的變化趨勢。
圖4 三種測試樣品對DPPH·自由基清除率曲線
由圖4可以總得出：3個測試樣品對DPPH自由基具有不同程度的清除效果，測試樣品隨著樣品濃度的增加，對DPPH自由基的清除率也逐漸增加。測試樣品玫瑰鮮花純露SS1和牡丹鮮花原液YS15清除率曲線交替上升，對DPPH自由基的清除能力基本處於同一水平；測試樣品牡丹鮮花原液YS16的清除率曲線基本呈線性關係，曲線斜率明顯大於另外兩個樣品的清除率曲線的斜率。
綜上可以看出，測試樣品壓榨過濾法製備的牡丹鮮花原液YS16對DPPH自由基的清除能力明顯高於測試樣品玫瑰鮮花純露SS1和蒸餾法製備的牡丹鮮花原液YS15。牡丹鮮花原液YS16在生產實踐常用濃度1.0-7.0%條件下，對DPPH自由基清除率為24.87-89。50%。
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