南京農業大學知名校友馬建鋒：植物營養學研究的科研思路

馬建鋒教授，國際著名植物營養學家、植物生物學國際頂尖科學家、日本岡山大學資源植物科學研究所教授。1984年從南農本科畢業後，馬建鋒公派前往日本京都大學攻讀碩士和博士學位，主要研究水稻矽(Si)的營養；1991年，獲得博士學位後，馬建鋒在Suntory(三得利)公司生物有機科學研究所開展麥根酸的研究工作，並在此期間探究出了麥根酸的生物合成途徑，獲得了1994年日本的「土壤肥料學會獎勵獎」。1995年，馬建鋒獲得擔任日本岡山大學助理教授的機會，酸性土壤中的鋁(Al)開始進入他的研究視野，1997年，馬建鋒的研究成果首次發表在了Nature上。1999年，馬建鋒成為日本香川大學副教授後，開展了植物礦質營養的分子生物學研究。2005年，馬建鋒以教授身份回到岡山大學後，取得了一系列世界前沿性的成果（來源於南京農業大學網站報導）。

一、鋁的研究

水稻（Oryza sativa L.）是小雜糧作物中的一個抗高鋁品種，但其抗高鋁的機理尚未闡明。本研究從耐γ射線的水稻品種中分離出3株抗γ射線的突變體。以根系相對伸長量作為評價抗鋁性的參數。經過初步篩選和兩輪驗證試驗，從560株系中分離出一株突變體（als1）。該突變體表現出與不含鋁的野生型植物相似的表型。然而，在10μm Al存在下，突變體的根系伸長受到抑制70%，而野生型植株僅抑制8%。突變體在酸性土壤中的根系生長也較差。野生型植株根尖（0～1cm）鋁含量較低。突變株與野生型植株對Cd、La等其它金屬的敏感性無差異。在鋁脅迫下，突變體根系分泌少量檸檬酸鹽，但與野生型植株的分泌量無差異。對als1與野生型植株F（2）群體的遺傳分析表明，抗鋁苗和鋁敏感苗按3:1的比例分離，表明als1對鋁的高敏感性是由一個隱性基因控制的。該基因被定位到6號染色體的長臂上，兩側有InDel標記MaOs0619和MaOs0615。STAR1也就是ALS1，編碼細菌型ATP結合盒（ABC）轉運蛋白的核苷酸結合結構域，而同源基因STAR2編碼跨膜結構域。任一基因的破壞導致對鋁毒性的超敏反應。STAR1和STAR2都主要在根中表達，並且由Al暴露特異性誘導。在洋蔥表皮細胞，水稻原生質體和酵母中的表達表明，STAR1與STAR2相互作用形成複合物，定位於所有根細胞的囊泡膜，除了成熟區表皮層中的那些。當在非洲爪蟾卵母細胞中一起表達時，STAR1/2顯示出對UDP-葡萄糖特異的外排轉運活性。此外，添加外源UDP-葡萄糖拯救了暴露於Al的star1突變體中的根生長。這些結果表明STAR1和STAR2形成複合物，其作為ABC轉運蛋白起作用，這是水稻中Al解毒所必需的。ABC轉運蛋白轉運UDP-葡萄糖，其可用於修飾細胞壁。

鋁（Al）毒性是酸性土壤上作物生產的主要限制因素，但一些植物物種已經進化出解毒Al的方法。通過根據先前描述的程序篩選射線照射的水稻（Koshihikari）的耐鋁品種的M3品系，分離對Al根毒性（art1）敏感的突變體。art1與其野生型之間的根和芽形態沒有差異。在沒有Al的情況下，突變體顯示出與野生型相似的根生長。然而，在Al存在下，art1的根伸長比野生型顯著受到抑制。發現C2H2型鋅指轉錄因子ART1（用於Al抗性轉錄因子1），其特異性調節水稻（Oryza sativa）中與Al耐受性相關的基因的表達。ART1在根中組成型表達，並且表達水平不受Al處理的影響。ART1定位於所有根細胞的細胞核中。酵母單雜交試驗表明，ART1具有轉錄激活潛能，並與STAR1的啟動子區域相互作用，STAR1是水稻Al耐受的重要因素。微陣列分析揭示了由ART1調節的31個下遊轉錄物，包括STAR1和2以及其他植物中Al耐受基因的幾個同源物。這些基因中的一些與不同細胞水平的Al的內部和外部解毒有關。我們的研究結果揭示了全面了解植物如何解毒鋁在酸性環境中存活。ART1是一種獨特的C2H2鋅指型轉錄因子，共調節31個基因。

1. 靶基因1

其中一個基因（Os02g0131800）被注釋為編碼一種屬於Nramp（天然抗性相關巨噬細胞蛋白）家族的蛋白質。發現一種轉運蛋白Nrat1（Nramp鋁轉運蛋白1），特異於水稻中的三價Al離子。Nrat1屬於Nramp（天然抗性相關巨噬細胞蛋白）家族，但與其他Nramp成員的相似性較低。當在酵母中表達時，Nrat1轉運三價Al離子，但不轉運其他二價離子，如錳，鐵和鎘，或檸檬酸鋁複合物。Nrat1定位於除表皮細胞外的所有根尖細胞的質膜上。敲除Nrat1導致Al吸收減少，Al與細胞壁結合增加，Al敏感性增強，但不影響對其他金屬的耐受性。Nrat1的表達被根中的Al上調並受C2H2鋅指轉錄因子（ART1）的調節。因此，我們得出的結論是，Nrat1是三價Al的質膜定位轉運蛋白，這是通過將Al螯合到液泡中進行最終Al解毒的先前步驟所必需的。酵母中的異源分析表明，Nrat1的Al轉運活性不受高濃度Ca存在的影響，但受到三價離子（包括Yb和Ga，Al的類似物）的顯著抑制。敲除Nrat1不影響水稻中Cd和Mn的吸收。另一方面，與野生型水稻相比，Nrat1的過表達導致水稻根吸收Al增強，但不影響Cd吸收。這些結果提供了進一步的證據，與其他Nramp成員不同，Nrat1是三價Al離子的流入轉運蛋白。

2. 靶基因2

有毒鋁迅速進入根細胞，因此需要內部解毒。然而，這一過程背後的分子機制知之甚少。在這裡，我們在功能上表徵了水稻基因Os03g0755100（OsALS1），其受ART1（C2H2型鋅指轉錄因子）調節。OsALS1編碼一半大小的ABC轉運蛋白，它是TAP（與抗原加工相關的轉運蛋白）亞組的成員。OsALS1的表達由根中的Al快速且特異性地誘導，但不被其他金屬或低pH誘導.OsALS1定位於根的所有細胞。此外，OsALS1定位於液泡膜。這些表達模式和定位的細胞特異性不同於擬南芥中同源基因AtALS1的表達模式和細胞特異性。在三個獨立的品系中敲除OsALS1導致對Al的敏感性顯著增加，但不影響對其他金屬的敏感性和低pH值。野生型和osals1突變體之間Al積累模式的比較表明，野生型和突變體之間根尖細胞汁液中Al水平沒有差異，但突變體在細胞質和細胞核中積累的Al比野生型更多。OsALS1在酵母中的表達由於錯誤定位導致Al敏感性增加。這些結果表明定位於液泡膜的OsALS1負責將Al隔離到液泡中，這是水稻中Al內部解毒所必需的。

3. 靶基因3

OsCDT3，其編碼僅富含半胱氨酸的53個胺基酸殘基的預測肽。敲除該基因導致對Al的耐受性降低，但不影響對Cd的耐受性。包括細胞壁和敲低株系質膜在內的根殘基中的鋁（Al）含量降低，但與野生型水稻相比，根細胞汁液中的Al濃度增加。OsCDT3主要在根中表達，其表達是由Al暴露特異性誘導的，而不是由低pH和其他金屬誘導的。OsCDT3表達水平存在較小的基因型變異，但17個水稻品種的Al耐受性與OsCDT3變異無相關性。對pOsCDT3：：GFP轉基因水稻的分析表明OsCDT3在根尖的所有細胞中都有表達。在N-和C-末端與GFP融合的OsCDT3的瞬時表達顯示OsCDT3錨定到質膜上。OsCDT3在酵母中的表達賦予對Al的耐受性，但不賦予對Cd的耐受性。此外，OsCDT3在酵母中不顯示Al的轉運活性，但能夠在體外直接結合Al。總之，我們的結果表明OsCDT3錨定到質膜可能通過結合Al阻止Al進入根細胞起作用，因此有助於水稻中的高Al耐受性。

4. 靶基因4：

OsEXPA10在根和芽中的表達水平相似，但只有根中的表達響應於Al而迅速上調。此外，空間表達分析表明，Al誘導的表達僅在根尖（0-3mm）中發現，而在成熟根區中未發現。該表達既不受包括Cd和La在內的其他金屬的誘導，也不受低pH的誘導。免疫染色顯示OsEXPA10定位於根尖的所有細胞。敲除OsEXPA10導致在不存在Al的情況下根的細胞伸長顯著降低。在Al存在下，敲除OsEXPA10不會改變通過相對根伸長評估的Al敏感性，但與野生型水稻相比，敲除系的根細胞壁積累的Al較少。總的來說，我們的結果表明，在根尖中表達的OsEXPA10是根細胞伸長所必需的，但是該基因對水稻中高Al耐受性的貢獻很小。

二、矽的研究

水稻（Oryza sativa）在頂部積累矽（Si）至最高莖幹重的10.0%，但不了解導致水稻根部高Si吸收的機制。我們通過篩選在25攝氏度下用10（-3）M疊氮化鈉處理6小時的水稻cv Oochikara的M（2）種子（64000），分離出活性Si攝取缺陷的水稻突變體（GR1）。野生型（WT）和GR1之間沒有表型差異，除了當供應Si時GR1的葉片保持流口水。吸收實驗表明，在低和高Si濃度下，GR1對Si的吸收顯著低於WT。然而，磷和鉀等其他營養素的攝取沒有差異。WT的木質部汁液中的Si濃度是外部溶液的33倍，但GR1的Si濃度比0.15mM Si的外部溶液高3倍。WT的Si吸收被包括NaCN和2,4-二硝基苯酚的代謝抑制劑以及低溫抑制，而GR1的Si吸收不受這些試劑的抑制。這些結果表明，GR1中Si吸收的主動轉運系統被破壞。對GR1和WT之間的F（2）群體的分析表明，具有高Si吸收的根和具有低Si吸收的根以3:1的比例分離，表明GR1是Si吸收的隱性突變體。lsi1（低矽水稻1）是矽吸收缺陷的水稻突變體。與野生型相比，該突變體在整個生長期內在枝條中積累較少的矽，並且易受害蟲和疾病的影響。該突變體的穀物產量是野生型水稻的十分之一。粗定位將控制矽攝取的基因（Lsi1）定位到2號染色體。為了精細定位Lsi1，我們使用了大約1000個矽吸收低的純合子，這些選自Lsi1純合子和秈稻品種Kasalath之間雜交的F2植物。我們開發了新的標記，並將Lsi1的候選區域映射到標記Lsi1-4和E60168之間的88千鹼基（kb）和標記Lsi1-a和Lsi1-6之間的13.9 kb。使用基因預測軟體，我們預測了候選區域中的一個基因，對其進行了測序，並在野生型和lsi1突變體之間進行了比較。我們在候選基因的DNA序列中發現了一個突變（野生型中的G；突變體中的a），該突變導致胺基酸從野生型中的丙氨酸變為132位突變體中的蘇氨酸。因此，我們認為該候選基因為Lsi1。該基因由五個外顯子和四個內含子組成。該基因的互補DNA長1409個鹼基對（bp），推導的蛋白質含有298個胺基酸。預計該基因編碼類似於水通道蛋白（水通道蛋白）5的膜蛋白。預測的胺基酸序列具有六個跨膜結構域和兩個Asn-Pro-Ala（NPA）基序，在典型的水通道蛋白中非常保守。BLAST搜索和ClustalW分析顯示Lsi1屬於Nod26樣主要內在蛋白（NIP）亞家族。該基因屬於水通道蛋白家族，在根中構成性表達。Lsi1定位於外皮層和內皮層細胞遠端的質膜上，casparian帶位於其上。抑制Lsi1表達導致矽攝取減少。此外，Lsi1在爪蟾卵母細胞中的表達僅表現為矽的轉運活性。矽轉運蛋白的鑑定不僅為深入了解植物的矽吸收系統提供了一個新的途徑，而且為通過基因改造植物根系的矽吸收能力來生產抗多種脅迫的作物提供了新的策略。

為了鑑定參與矽外排轉運的基因，我們使用對鍺的耐受性作為選擇參數，篩選了矽吸收缺陷的新水稻突變體。鍺是矽的類似物，植物根部以類似於矽的方式吸收鍺葉上的褐色斑點。然而，鍺對植物有毒。我們從大約4600 cm3的種子（cv。臺中65）用N-甲基-N-亞硝基脲誘變，命名為突變體低矽水稻2（lsi2）。我們構建了一個F2作圖群體，該群體來源於lsi2和秈稻品種Kasalath之間的雜交。我們使用F2植物通過大量分離分析將基因（Lsi2）大致定位到3號染色體的遠端區域。低矽水稻2（Lsi2），它與Lsi1沒有相似性。該基因在根中組成型表達。該基因編碼的蛋白質與Lsi1一樣定位於外胚層和內胚層細胞的質膜上，但與Lsi1定位於遠端相反，Lsi2定位於同一細胞的近端。Lsi2在非洲爪蟾卵母細胞中的表達不會導致矽的流入轉運活性，但是用矽預加載卵母細胞會導致矽的釋放，表明Lsi2是矽的流出轉運蛋白。這種矽轉運蛋白的鑑定揭示了植物中營養轉運的獨特機制：一側具有流入轉運蛋白，另一側具有流出轉運蛋白，以允許營養物的有效跨細胞轉運。

Si吸收的主要部位位於根部的基部區域（距根尖>10mm），而不是根尖（距根尖<10mm）。與Si攝取模式一致，Lsi1蛋白的Lsi1表達和分布僅在根的基部區域中發現。在花粉，冠和側根的基底區域，Lsi1蛋白在形成Casparian條帶的外胚層和內胚層的遠端顯示極性定位。這表明Lsi1是通過外胚層和內胚層細胞轉運Si所必需的。Lsi1的表達顯示出明顯的晝夜模式。此外，在抽穗期周圍表達瞬時增強，這與在該生長期期間的高Si要求一致。表達受脫水脅迫和脫落酸的下調，表明Lsi1的表達可能受脫落酸的調節。

OsNIP2；1（Lsi1，矽流入轉運蛋白）中的突變顯著降低亞砷酸鹽吸收。此外，在矽外排轉運蛋白Lsi2缺陷的水稻突變體中，亞砷酸鹽向木質部的轉運和芽和籽粒中的積累大大減少。與Lsi1相比，Lsi2突變對田間水稻芽和籽粒中砷積累的影響更大。因此，水稻根中的亞砷酸鹽轉運與矽具有相同的高效途徑，這就解釋了為什麼水稻在砷積累方面有效。我們的研究結果提供了對水稻中亞砷酸鹽吸收機制的深入了解，以及減少穀物中砷積累以提高食品安全性的策略。

基於同源性研究，在水稻基因組中存在Si流入轉運蛋白Lsi1的緊密同源物（Os NIP2；2；本文中命名為Lsi6）。我們通過PCR從水稻根的cDNA中分離出該基因。Lsi6由5個外顯子和4個內含子組成，具有894bp的開放閱讀框，編碼298個胺基酸的蛋白質。轉運蛋白Lsi6，它參與了芽中Si的分布。Lsi6屬於水通道蛋白的nodulin-26內在蛋白III亞組，可滲透矽酸。Lsi6在葉鞘和葉片以及根尖中表達。細胞定位研究表明，Lsi6存在於葉鞘和葉片的木質部薄壁細胞中。此外，Lsi6在面向容器的一側顯示極性定位。敲除Lsi6不影響根對Si的吸收，但導致二氧化矽在芽中的無序沉積和Si在滴液中的排洩增加。這些結果表明，Lsi6是負責將Si運輸出木質部並隨後影響葉中Si分布的轉運蛋白。Lsi6是水稻（Oryza sativa）中的矽轉運蛋白，當穗完全出現時，其在穗下方的節點I中的表達大大增強。Lsi6主要定位於位於節點I中擴大的大維管束的外邊界區域的木質部轉移細胞.Lsi6的敲除減少了穗中的Si積累，但增加了旗葉中的Si積累。這些結果表明Lsi6是參與血管間轉移的轉運蛋白（即，從根部到連接到圓錐花序的擴散維管束的大維管束的矽轉移）。這些發現將有助於選擇性地增強必需營養素的積累和減少穀物可食用部分中的有毒礦物質。

三、Mn研究

水稻（Oryza sativa）能夠積累高濃度的Mn而不顯示毒性；然而，Mn吸收的分子機制尚不清楚。在擬南芥和水稻（Oryza sativa）基因組中，分別有六個和七個成員，其中一些成員已經過功能表徵。在擬南芥中，Nramp1,3和4在酵母中顯示出Fe，Mn和Cd的轉運活性，而Nramp6僅轉運Cd但不是Fe。Nramp2在酵母中未顯示Fe的轉運活性，其確切功能尚不清楚。Nramp1定位於根細胞的質膜，並作為Mn攝取的高親和力轉運蛋白。相比之下，水稻中存在的七個Nramp基因中只有兩個在分子水平上得到了表徵。Nramp（用於天然抗性相關巨噬細胞蛋白）家族的成員Nramp5參與Mn攝取並隨後在水稻中積累高濃度的Mn。Nramp5在根中組成型表達並編碼質膜定位蛋白。Nramp5極性定位於外胚層和內胚層細胞的遠端。敲除Nramp5導致生長和穀物產量顯著降低，特別是當在低Mn濃度下生長時。通過提供高濃度的Mn而不是通過添加Fe可以部分地挽救這種生長減少。礦物分析表明，敲除品系中根和芽中Mn和Cd的濃度低於野生型水稻。短期攝取實驗表明，敲除品系失去了攝取Mn和Cd的能力。總之，Nramp5是Mn和Cd的主要轉運蛋白，負責將Mn和Cd從外部溶液轉運到根細胞。

三、鎘研究

過去從大米中攝入有毒鎘（Cd）會導致痛痛病，仍然是對人類健康的威脅。因此，控制土壤中Cd的積累是一個重要的食品安全問題，但控制的分子機制尚不清楚。糙米（Oryza sativa）中低鎘（Cd）積累的特點對食品安全具有重要意義。減少穀物中Cd積累的有效方法是控制Cd從根到芽的轉移。

1. 在這裡，我們調查了來自水稻核心集合的146個種質中枝條Cd濃度的基因型變異，並進行了數量性狀基因座（QTL）分析以確定控制枝條Cd積累的基因座。此外，我們在生理學上表徵了用於QTL分析的兩個種質。發現芽Cd濃度的大基因型變異（13倍）。使用來自Badari Dhan（高Cd登錄號）和Shwe War（低Cd登錄號）的F2群體在11號染色體上檢測到主要QTL。該QTL解釋了Cd積累中16.1%的表型變異。此外，通過對晚期後代的分析證實了該QTL。生理學研究表明，Badari-Dhan和Shwe-War對根的Cd吸收沒有差異，但Cd從根到芽的轉運差異很大。總之，我們的研究結果表明，檢測到的主要QTL負責Cd從根到芽的轉運。

2. 發現一種基因（OsHMA3），其負責水稻中低Cd積累，該基因是從源自高和低Cd積累品種之間雜交的作圖群體中分離的。即當在同一田地中生長時，Anjana Dhan在枝條（葉片和鞘）和糙米（去殼穀物）中顯示出比Nipponbare高几倍的Cd積累。該基因編碼屬於P（1B）型ATPase家族的轉運蛋白，但與其他成員的相似性較低。酵母中的異源表達表明，低Cd品種的轉運蛋白具有功能，但高Cd品種的轉運蛋白失去了功能，這可能是由於單個胺基酸突變所致。在低和高Cd積累品種中，轉運蛋白主要在根細胞的液泡膜中以相似的水平表達。來自低Cd積累品種的功能基因的過表達選擇性地降低了Cd的積累，但沒有降低穀物中的其他微量營養素。我們的研究結果表明，來自低Cd積累品種的OsHMA3通過選擇性地將Cd螯合到根液泡中來限制Cd從根轉移到地上組織。

四、砷研究

砷（As）是一種慢性毒物，會導致嚴重的皮膚病變和癌症。水稻（Oryza sativa L.）是砷的主要膳食來源；因此，減少水稻籽粒中的砷積累，從而減少進入食物鏈的砷含量至關重要。在這裡，基於擬南芥同源比對，水稻C型ATP結合盒（ABC）轉運蛋白（OsABCC）家族成員OsABCC1參與了水稻籽粒中As的解毒和還原。我們發現OsABCC1在許多器官中表達，包括根，葉，節，花梗和軸。當植物暴露於低水平的As時，表達不受影響，但響應於高水平的As而上調。在連接到穗的基部節點和上部節點中，OsABCC1定位於維管束的韌皮部區域。此外，OsABCC1定位於液泡膜並賦予酵母中植物螯合素依賴性As抗性。水稻中OsABCC1的敲除導致對As的耐受性降低，但不影響鎘毒性。在繁殖生長階段，野生型水稻的節點和其他組織中的As含量高於OsABCC1敲除突變體，但在穀物中顯著降低。總之，我們的結果表明OsABCC1通過隔離如在水稻節點的韌皮部伴隨細胞的液泡中限制As轉運至穀物。