胎牛血清使用中的常見問題

2021-01-18 醫學生學術(MSA)

1、 如何儲存和解凍血清才不會使產品質量受損?

將血清從冷凍箱取出後,先置於2~8℃冰箱使之融解,然後在室溫下使之全融。但必須注意的是,融解過程中必須規則地搖晃均勻。

長時間儲存在2-8℃時,血清中的各種蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等)可能聚集而形成沉澱或可見的混濁。因此,推薦在-20℃以下儲存血清,並避免反覆凍融。

我們建議血清應保存在-2O℃。若存放於4℃時,請勿超過一個月。若一次無法用完一瓶,建議無菌分裝血清至恰當的滅菌容器內,再放回冷凍。

2、血清中包含絮狀沉澱,它們是什麼,怎麼處理?

沉澱包含纖維蛋白和脂蛋白。這是正常特性,不會影響產品性質。要除去沉澱,離心血清(400g,1-2分鐘)或者簡單的讓其沉澱在瓶子底部,將血清小心的轉移到另一個無菌瓶裡(一般不建議採用過濾的方法除去沉澱,因為沉澱會堵塞濾膜而無法過濾)。大多情況輕輕搖動沉澱並加熱至37℃就會再溶解。所以,使用產品時要搖動並加熱血清至37℃,沉澱會自然消失。

3、實驗室如何選擇適合的血清?

國內一致認為HYCLONE的血清是最好的,但是根據我在北美的經歷,國外一般認為GIBCO比HYCLONE好,所以並不是價格決定質量,但是總的來說這兩種價格普遍偏貴,一般不是太嬌氣的細胞,國產的就夠用了。此外,由於國內HYCLONE,GIBCO並沒有生產線,我們只能從代理商那裡買,而代理商又魚龍混雜,所以買到假貨的可能性也很大。所以,我一般會從直銷員那裡買血清,有的國外生物公司由於剛剛進入中國,知名度不高,但是其實在國外已經做得很不錯了,如Wisent等,他們在國內有辦事處,我會從那裡拿,血清的品質和HYCLONE不相上下,但價格相對優惠很多。

4、 如何避免血清中產生沉澱?

按如下操作可避免沉澱的產生:

(1)解凍血清時,請隨時將之搖晃均勻,使溫度及成分均一,減少沉澱的發生。

(2) 血清分裝凍存時,須規則搖晃均勻(小心勿造成氣泡),使溫度與成分均一。

(3) 勿直接由-20℃直接至37℃解凍,因溫度改變太大,容易造成蛋白質凝結而發生沉澱。

(4) 勿將血清置於37℃太久,否則血清會變得渾濁,同時血清中許多較不穩定的成份也會因此受到破壞,從而影響血清的品質。

(5) 血清的熱滅活非常容易造成沉澱物的增多,若非必要,可以無須做此步驟。

(6) 若必須做血清的熱滅活,請遵守56℃,30分鐘的原則,並且隨時搖晃均勻。溫度過高,時間過久或搖晃不均勻,都會造成沉澱物的增多。

5、 培養基中添加了血清和抗生素後,可長期保存嗎?

一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時,您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍後就開始降解。

6、 為什麼要熱滅活血清?

加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件,刺激平滑肌收縮,細胞和血小板釋放組胺,激活淋巴細胞和巨噬細胞。在免疫學研究,培養ES細胞、平滑肌細胞時,推薦使用熱滅活血清。

7、 有必要做熱滅活嗎?

實驗顯示,經過正確處理的熱滅活血清,對大多數的細胞而言是不需要的。經此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進,或完全沒有任何作用,甚至通常因為高溫處理影響了血清的質量,而造成細胞生長速率的降低。而經過熱處理的血清,沉澱物的形成會顯著的增多,這些沉澱物在倒置顯微鏡下觀察,像是「小黑點」,常常會讓研究者誤以為是血清遭受汙染,而把血清放在37℃環境中,又會使此沉澱物更增多,使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。

若非必須,可以不需要做熱處理這一步。不但節省時間,更確保血清的質量!

8、細胞培養中出現黑點是汙染嗎?如何處理?

一旦您在細胞培養的過程中發現有黑點生成,首先,要肉眼觀察培養基是否混濁,然後,在鏡下觀察培養細胞生長的狀態,黑點是否遊動。如果細胞被汙染,微生物則會大量繁殖,培養基就會迅速變黃、變混濁。汙染包括細菌汙染、支原體汙染等。

如果在鏡下觀察細胞,生長狀態良好,與黑點出現前相比,沒有任何變化,那麼,黑點的出現可能與以下幾種情況有關:

(1)細胞生長過老,破碎的細胞殘骸;

(2)血清質量不好,反覆凍融的結果;

(3)配製培養基的pH值偏高,不宜細胞生長;

(4)配製培養基的水質、容器不合格。可應用離心、過濾的方法去除這些黑點;

(5)培養原代細胞中出現小黑點,可能是原代組織中的雜質,多次傳代可以消除。

9、 細胞培養中如何防止黑點生成?

(1) 儘可能地減少血清凍融次數。

(2) 培養基無需37℃水浴。

(3) 培養基保持最佳PH值7.0- 7.2。

(4) 嚴格控制配製培養基的水質,容器定期刷洗。

(5) 掌握細胞傳代的最佳時機,細胞切勿生長過老。

10、小牛血清和胎牛血清有何區別與注意事項?

來源不同:胎牛血清(Fetal Bovine Serum ,FBS) 是在屠宰懷孕母牛的時候,通過心臟穿刺採血獲取的胎牛的血清,新生牛(小牛)血清(Calf serum, CS)採自出生10至14 天的小牛。

組份與比例不同:兩者所含的促細胞生長因子、促貼附因子、激素及其他活性物質等組份與比例不同,用途與用法不同:某些細胞必需胎牛血清才能生長,而有些細胞只需小牛血清即可,使用濃度不同,一般在5%-10%,有特殊要求的濃度在20%。

血清保存和使用須注意:血清應保存在-5℃至-20℃,若存放在4℃不可超過一個月。解凍血清時 ,應先將血清至於2-8℃冰箱,並經常搖勻使之溶解,然後至室溫放置使之升溫,絕對不可將冷凍的血清直接放入37℃水浴或者溫箱中,如放在37℃解凍,顏色加深,粘稠度也會增加,血清在解凍和熱滅活後,應按用量分裝並於-20℃保存,避免反覆凍融。

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  • 胎牛血清給細胞帶來的益處
    胎牛血清是細胞培養中常用必備的添加培養基。它營養豐富,大約含有三四百種不同成分,具有基礎培養基所不具備的營養因子。 又如胎牛血清中富含胎球蛋白(Fetuin),具有多個鈣離子結合位點,因而能調節和維持血清中的鈣離子濃度。 3>天然含有粘附蛋白等細胞外基質成分,促進細胞的附著、鋪展。 4>提供解毒功能。這主要通過血清中的某些蛋白與有毒的金屬離子結合來完成的。
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    內毒素直接參與細胞凋亡,血清中內毒素含量越低,對細胞毒性越小,越利於細胞的生長和傳代;內毒素含量過高,會直接導致細胞提前老化。國際上規定,胎牛血清的級別,應以內毒素水平的高低來確定,其中,特級胎牛血清的內毒素應 二、血紅蛋白含量 胎牛血清的顏色會根據血紅蛋白含量的不同表現出黃色、淡黃色、橘紅色、微紅色等。
  • 進口胎牛血清的主要來源地是哪裡?
    血清的取血標準都有嚴格的規定,不同時間的取血所生產的產品也是不一樣的。因為國產胎牛血清的品質問題,中國的胎牛血清主要依靠進口;又因為各種原因諸如狂牛症、生物安全等,胎牛血清進口不是件容易的事。好在無論如何,總還是有渠道可以進口到胎牛血清的。
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    經典/基礎培養基屬於合成培養基,是根據天然培養基的成分,用化學物質模擬合成、人工設計、配製的培養基,但與天然培養基相比,有些天然的未知成分仍然無法用已知的化學成分所替代,因此,細胞培養中使用合成培養基時必須加入額外的營養成分,以克服合成培養基的不足。