一、臍血MNC分離：
1、將臍血袋剪開，分裝在50ml離心管中，每管20ml。
2、離心1500rpm，10min。
3、取出上層血漿，送質檢部檢測病毒和支原體。
4、取出分界處附近細胞，用D-hanks重懸，比例為1：1。
5、在50ml離心管中加入20ml Ficoll淋巴細胞分離液，將上述細胞懸液加到Ficoll分離液上方，分離液與細胞懸液比例為2：3。
6、離心2000rpm，25min，20℃，升速slow，降速off。
7、用移液管吸去上層血漿，小心取出分界處白膜層細胞，分到兩個50ml離心管中，每管加D-hanks 40ml重懸。
8、離心400g，8min，4℃，升降速調到最大。
9、吸去上清，細胞沉澱加適量D-hanks重懸。
10、離心400g，8min，4℃，升降速調到最大。
11、吸去上清，細胞沉澱加適量D-hanks重懸。
12、離心400g，8min，4℃，升降速調到最大。
13、吸去上清，細胞沉澱用含1% FBS的RPMI-1640培養基重懸，計數後調整細胞濃度為4*106/ml，接種到T175培養瓶中，置孵箱中孵育2h。
二、DC培養：
1、2h後取出培養瓶，鏡下觀察有細胞貼壁，吸去懸浮的細胞，並加入少量培養基衝洗瓶底兩次，將洗液與懸浮細胞混合，計數後離心後用於培養CIK細胞。
2、根據貼壁細胞數（接種細胞總數減去懸浮細胞數），沿瓶口緩慢加入DC無血清培養基，細胞濃度1*106/ml，並添細胞因子DC-5（0.1μl/ml）和DC-6（0.1μl/ml）。
3、第三天加半量培養基，並補充細胞因子DC-5（0.1μl/ml）和DC-6（0.1μl/ml）。
4、第五天進行促熟，加入腫瘤裂解液10-100μg/ml ，孵育24h。
5、第六天加入DC-A（0.5μl/ml），DC-B（1μl/ml），DC-C（1μl/ml），DC-D（1μl/ml），孵育24h。
6、第七天收穫的成熟DC細胞，將細胞從培養瓶中吸取到50ml離心管中，並加入D-hanks衝洗瓶底兩次，收集細胞。
7、將細胞離心，400g，8min，4℃，升降速調到最大。
8、吸去上清，細胞沉澱加適量D-hanks重懸。
9、離心，400g，8min，4℃，升降速調到最大。
10、吸去上清，細胞沉澱加含10% FBS和CIK-2'（1μl/ml）的RPMI-1640完全培養基重懸到40ml，加入到CIK細胞培養體系中。
三、腫瘤組織消化
1、將手術後取得腫瘤組織於D-hanks中浸泡，清洗表面血汙。
2、將腫瘤組織浸於75%酒精中，超聲10s。
3、將腫瘤組織浸於含500U/mL雙抗的D-hanks中2h。
4、取出腫瘤組織，用D-hanks衝洗後剪碎，放到藍蓋瓶中，加入1倍體積以上的膠原酶NB4（0.2%）和DNase I（5U/mL）消化1-2h。
5、將消化液過濾粗漏，並用適量 D-hanks衝洗濾渣。
6、消化液離心1500rpm，15min。
7、吸去上清，沉澱加適量 D-hanks重懸，過濾300目濾網。
8、離心1500rpm，10min，重複兩次。
9、細胞沉澱用含10% FBS的DMEM培養基重懸，計數，按1*106/mL的濃度接種到培養瓶中。
10、第二天觀察細胞貼壁情況並換液，根據生長情況傳代。
四、腫瘤細胞裂解
1、將培養的腫瘤細胞用胰酶消化後，用D-hanks懸浮，濃度為5*106 /ml，加到凍存管中，每管1mL。
2、將凍存管浸於液氮中冰凍（5~10mim）後於37℃水浴使融化，反覆凍融5次。
3、凍融後離心300g，10min，收取上清。
4、蛋白裂解液經0.22μm濾膜過濾，測蛋白濃度，凍於-80℃待用。