「乾貨」超高功率LED光源+光遺傳學等技術，會產生什麼火花？

過去，實驗室一直依賴水銀燈或氙燈作為螢光和明場顯微鏡的光源。近年來，越來越多的研究人員選擇改用LED光源。本文中我們就選用LED光源都有哪些優點以及該如何選擇LED光源展開說明，並簡單介紹幾個LED光源在很多新興技術上的應用。

大綱

一）LED光源的優勢

二）選擇適合的LED光源

三）LED光源在新興技術上的應用

1，LED光源的優勢

相比較傳統的水銀燈或氙燈光源，LED光源有如下一些優點：

1LED的成本更低，更節能，壽命更長

一般來說，水銀電弧燈的壽命約為200小時，而且這個數字還受啟動次數的影響，更換燈泡的成本也很高。LED光源中的LED晶片則不需要更換，可以持續穩定使用10,000小時或更長時間。另外，LED光源不需要預熱，可以即時啟動工作。

Fig. 1 UHP-F

2LED的光線更加均勻

水銀燈的光在中間最亮，越往兩邊會變暗，形成了邊緣不均勻、傾斜的景象，這樣對最後的成像帶來非常大的影響。而LED的亮度在整個視野中是均勻的，這對於在物鏡下獲得樣品的高質量圖像極為重要。

3LED更環保

汞對人類、野生動物和環境都有極大的危害，如果處置不當，對環境產生極大危害，而LED則不存在此類對人體和環境汙染的風險。

2，選擇適合的LED光源

在考慮將螢光顯微鏡升級為LED光源時，有哪些事情需要注意呢？有些問題是很明確的，比如選擇一個特定的光譜。但有些問題可能並沒有注意到，但對後期的使用可能產生很大的影響，這裡總結了一些需要重點考慮的因素：

1哪些因素決定了多少光會到達物鏡

有四個主要因素決定了有多少光能照射到顯微鏡物鏡上：

1）LED的功率

2）LED發光面積

3）發散角度

4）光束直徑

Fig. 2 UHP-T-460

你需要的是功率最高的LED，同時具有發射面積最小，準直度最小以及合適的光束直徑以保證光線充滿光路而不會過滿。這些因素將決定有多少有用的光能照射到物鏡。在比較不同的LED時，請記住這一點：LED表面以mW/mm^2為單位的功率越高，就越有機會在你最需要的地方（即物鏡下）獲得更多的光。

基於陣列的LED（即多顆LED晶片）通常具有較大的發光面積，而且光線不均勻。而單發光體LED（即單顆LED晶片）的發光面積較小，發散度較低。

Fig. 3 基於單顆晶片的LED光源

2LED光源是否有很強的電磁幹擾？

有些LED光源會從LED或電纜上發出電磁幹擾。這將會影響到對電磁幹擾要求極高的電生理應用。

所有的Prizmatix UHP-T型號的LED都經過特別優化設計，可直接安裝在顯微鏡上，減少電磁幹擾對實驗的影響，特別適用於精密的電生理學。

3LED是否可以用於高速成像？

LED驅動器電子設備通常具有一個鋸齒狀的邊緣，導致LED亮度會有波動，最高可達10％的亮度變化。對於低速成像來說這不是問題，因為光線會隨時間被平均。但是，對於每秒數千幀的高速成像，這些波動會在圖像中產生很明顯的噪音。因此，在選購LED光源時要確認是否需要具有此功能。

Prizmatix LED採用特殊低噪音驅動器，已成功地用於高達每秒50萬幀的成像，噪聲可低至0.1%。如果您的應用需要非常安靜的光學輸出，請務必與我們的顧問聯繫，以獲得低噪音LED光源。

4是否能和光纖一起使用或直接使用

這正是Prizmatix LED的優勢所在。Prizmatix LED的模塊化設計使其真正實現了多功能甚至多波長模式。Prizmatix主要使用高NA值的POF光纖或者液態光波導，實現很高的轉換效率。

3，LED光源在新興技術上的應用

我們一起分享幾個利用超高功率LED光源解決實際問題的具體案例。

應用

1. 電壓敏感染料成像

2. 高光譜成像

3. 光遺傳學和斑馬魚

4. 培養箱內的光刺激

5. 核磁共振波譜

6. OptiBlocks模塊化設計

01電壓敏感染料成像

電壓敏感染料（Voltage-sensitive dye，VSD），也稱為電位染料，是響應電壓變化而改變其光譜特性的染料。它們能夠提供單個神經元、神經元種群或心肌細胞放電活動的線性測量。許多生理過程都伴隨著細胞膜電位的變化，而VSD可以檢測到這種變化。測量的結果可以指示動作電位起源的位置，並且可以獲得動作電位速度和方向的相關信息。

VSD用於監測無法插入電極的細胞器內部的電活動，例如線粒體和樹突脊，這也使得沿著單個細胞表面的膜電位的空間和時間變化的測量成為可能。VSD會根據膜電位改變其吸收或發射螢光，從而使科學家能夠測量神經元的整體電學狀態。與細胞外電生理技術不同，除了spike放電活動，VSD還可以檢測亞閾值的突觸電位。

VSDI（VSD imaging，VSDI）技術就利用了VSD的這種電學特性，通過高速攝像機將細胞的電活動可視化，具有高空間解析度（低至20-50um）和高時間解析度（低至毫秒），有了這樣的解析度，可以用來研究單個神經元或者群體神經元的放電活動。

Fig.4 神經元群體中的全光學控制和抑制作用的檢測。

（A）左-VSD染色的小腦切片的螢光圖像，指示浦肯野細胞層（PCL），分子層（ML）和顆粒細胞層（GCL）的位置。右–在整個顯微鏡視野內，光刺激ML中間神經元產生的VSD信號。跡線指示在左側圖像中指示的3個編號位置處檢測到的信號。（B）在光刺激ML中間神經元後的各個指示時間產生的VSD螢光變化的圖像。螢光的變化（ΔF/ F0）由右側所示的偽彩色標尺指示。

參考文獻：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168010212002325?via%3Dihub

02高光譜成像

高光譜顯微鏡（Hyperspectral-Microscopy imaging，HSI）是一種先進的可視化技術，它將高光譜成像與最先進的光學和計算機軟體結合起來，能夠快速識別微觀和納米尺度的材料，還可以用來定位、鑑定和表徵它們。

這裡所說的高光譜，指的是測量的波長範圍，通常包括近紅外、可見光，有時還包括近紫外光譜。其原理是將分光光度計和成像技術結合起來：先進的光學技術和算法可以捕獲每個像素的整個光譜，而不是拍攝每個像素的單一主導波長的照片。由於這給本來是二維的圖像增加了另一個維度，高光譜圖像有時被稱為數據立方體。通過收集參考材料的光譜，可以將這些參考光譜與高光譜圖像相關聯，以確定圖像中感興趣的特定材料。這構成了該技術的基礎及其主要優勢：能夠同時對不同的、異質的樣品進行成像，並識別存在的材料。

HSI目前主要的應用領域包括：農業和食品安全領域，臨床和科研檢測，化學成像，礦物質檢測，環境檢測，天文學等多個領域。

Fig.5 用於可視化秀麗隱杆線蟲細胞內的納米粒子內化的CytoViva®應用實例。

AgNP被攝入並內化到秀麗隱杆線蟲的細胞中。（a）秀麗隱杆線蟲將CIT10 AgNP與食物一起攝取。（b）一些CIT10 AgNP也被吸收到線蟲的細胞中，並轉移給後代。通過HSI分析確認了AgNP的身份。

Prizmatix CombiLED光纖耦合LED光引擎使用二向色鏡結合了多個高功率LED，並將輸出耦合到光纖或光導中。其中一個重要應用領域就是高光譜顯微鏡（Hyperspectral-Microscopy imaging，HSI）。

該系統包括所有LED驅動器電子設備和主動散熱模塊。該產品的模塊化設計可根據客戶的特定要求進行定製，具有如下主要特點：

1. 單個19英寸機架式機箱中多達8個大功率LED

2. 提供大功率紫外線，可見光和近紅外LED

3. LED波長和二向色鏡組合器的選擇都可以通過在線LED-Spectra-Viewer進行模擬配置，根據實驗需要選擇合適的波長組合

4. 多種控制模式可選：高精度電位器、模擬輸入或使用電腦通過USB或RS232精確控制(12位DAC)

5. 每個LED通道均可單獨通過TTL輸入觸發ON/OFF。

Fig.6 CombiLED光纖耦合LED引擎示意圖

參考文獻：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/wnan.1330

03光遺傳學和斑馬魚

光遺傳學方法是近十年來在神經科學領域迅猛發展的一項光控細胞新技術。該生物工程技術整合了光學、遺傳學、計算機科學、基因工程、細胞生物學、電生理等眾多學科。這項由多學科交叉應運而生的新型技術極大地推動了神經科學的發展，進而擴展到動物行為學、臨床醫學、分子生物學、細胞生物學等眾多領域。在齧齒動物研究中，Prizmatix提供了完善的在體和離體解決方案：

Fig.7 Prizmatix在體（左）和離體（右）光遺傳學解決方案

而在其他模式動物上，Prizmatix同樣也提供了成套的解決方案。斑馬魚是目前生命科學研究中重要的模式脊椎動物之一。斑馬魚基因與人類基因的相似度達到87%，而且它們的身體是半透明的，可以很容易監測到神經活動，有「水中小白鼠」之稱。由於斑馬魚幼魚是透明的，在斑馬魚幼魚中應用光遺傳學刺激不需要光纖，只需要朝正確的方向發光，就可以輕鬆研究特定神經元在行為中的作用。

Noldus公司的DanioVision產品就用到了Prizmatix的LED光源組件，利用動物運動軌跡跟蹤系統自動控制LED光源的觸發時間和刺激強度，可以同時精確控制多達96個個體（使用96孔板）進行光遺傳刺激。

Fig.8 Noldus公司的DanioVision產品

DanioVision的光遺傳學組件是基於Prizmatix模塊化LED光源系統。它由兩種不同的LED波長組成，藍光和黃光或兩種顏色的組合，分別達到刺激或者抑制神經元活動的作用。

除了Noldus，另外包括MED以及DSI都採用了Prizmatix的LED光源產品作為其光遺傳學的配置方案，在硬體上實現有效整合之外，軟體上也實現對Prizmatix光源快速、精確的控制。

參考文獻：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S009286741930220X

https://www.cell.com/neuron/fulltext/S0896-6273(19)30010-8

04培養箱內的光刺激

我們偶爾會被問到的一個具有挑戰性的應用是孵育器或者培養箱內的光照刺激。一般在這種炎熱、潮溼和擁擠的條件下，很難提供高強度的光照。一位研究人員需要在微孔板大小的一個區域內照射強烈的藍光，以激活光敏感通道蛋白。有很多原因沒辦法將超高功率LED光源直接放置在孵育器中，主要是擔心透鏡上的冷凝水會損壞LED，還有空間受限以及LED風扇的幹擾等限制。

通過在孵育器外的超大功率LED上安裝了一個液態光導器，經過一些微調，以平衡強度，使細胞不被強光破壞，LED成功地照亮了微孔板並激活了ChR2。

UHP-F產品系列的超高功率導光管耦合LED，是在孵育器或培養箱內提供強光的理想解決方案。UHP-F 有紫外光、可見光和白光三種類型，可通過3或5毫米液體光導器提供高達4瓦的強光。Prizmatix可提供定製的準直器，將光線引導到目標處，以達到每平方釐米的最大功率。

Fig. 9 UHP-F超高功率LED光源

參考文獻：

https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(19)30167-6

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0896627320302233

05核磁共振波譜

核磁共振波譜法（NMR spectroscopy），又稱核磁共振波譜，是將核磁共振現象應用於測定分子結構的一種譜學技術，LED光源在其中也可以發揮很大的作用。其中越來越受歡迎的一個應用是光纖耦合LED用於NMR光譜分析。選擇適合NMR的光源，首先最重要的就是要做到核磁兼容，另外要提供足夠的光強。其中最受歡迎的一個配置是Mic-LED光源、控制器、光纖耦合適配器和一根長的POF光纖。此配置可與各種波長的LED一起使用，最常用的波長配置是445和365nm。

光纖一端通過適配器連結LED光源，另一端的光纖包層需要去掉，以使光從側面漏出。光纖被剪切在一個透明的塑料護套內，該護套插入到一個較大的管子裡，裡面有被分析的化合物，光纖組件置於磁場中進行檢測分析。

這種設置的優點是，不同波長的LED可以用同一個控制器和光纖適配器來使用，需要其他波長只需要更換LED光源即可。

Fig.10 Prizmatix NMR套件

這個設置可以在下列兩篇參考文獻的 &34;中看到。

另外，LED光源也可以和核磁成像等應用結合使用，我們團隊有非常豐富的核磁環境下的配置經驗，具體可以諮詢我們以獲得更多幫助。

參考文獻：

「Discovery of a Photoinduced Dark Catalytic Cycle Using in Situ LED-NMR Spectroscopy」. September 2018

「Facile Quantum Yield Determination via NMR Actinometry」 March 2018

06OptoBlocks模塊化設計

Prizmatix模塊化的LED可直接安裝在顯微鏡的螢光埠上，也可以與光纖耦合器一起使用，也可與一個或多個LED組合成多波長光源。

Prizmatix Optiblocks是實現測光系統光學部分的理想方法。與籠式系統相比，剛性的Lego型模塊已預先對準，節省了很多時間和麻煩。Prizmatix Optiblock模塊易於配置和重新配置，包括光束組合器，光源，光纖耦合器等。使用標準的SM1螺紋，可以輕鬆安裝濾光片和其他光學組件，並與其他供應商的零件集成在一起。

Fig.11 Prizmatix OptoBlocks示意圖

目前提供的波長有：365nm、385nm、390nm、395nm、400nm、405nm、410nm、415nm、420nm、425nm、430nm、435nm、440nm、445nm、455nm、460nm、465nm、470nm、480nm、550nm、595nm、500nm、505nm、515nm、535nm、550nm、595nm、620nm、630nm和白光。

其他波長，包括紅外和近紅外，可根據要求提供。