·這篇論文作者是復旦大學公共衛生學院張永振教授，論文提交到《自然》的時間是1月7日，最終在2月3日發表。研究團隊從1位患者身上提取出了病毒的完整基因組，該團隊是最早公布病毒基因組的團隊。
·研究證實該病毒與SARS同屬於冠狀病毒，但是一種新型的冠狀病毒。
·新型冠狀病毒有效地利用人ACE2作為細胞進入受體，從而使得其更容易感染人類。
·通過基因組序列對比表明，新型冠狀病毒與感染人類的SARS病毒或蝙蝠身上的類SARS病毒之間發生了基因重組，但還不能推定是基因重組促進了新型冠狀病毒的誕生。
這篇論文是上海公共衛生臨床中心、復旦大學公共衛生學院張永振教授帶領團隊研究所寫，文章提交給Nature雜誌的時間是1月7日，過了接近一個月才正式發布。張教授是第一位公布該病毒序列的科研工作者，1月10日便已公布序列。
SARS和Zika等新型傳染病對公共衛生構成了重大威脅。儘管進行了廣泛的研究，但是如何，何時以及何地出現新疾病仍然是相當不確定。最近在中國湖北省武漢市報告了一種嚴重的呼吸系統疾病。自第一位患者於2019年12月12日住院以來，截至2020年1月25日，已報告至少1,975例病例。流行病學調查表明，此次爆發與武漢的海鮮市場有關。我們研究了一名在市場上工作的患者，該患者於2019年12月26日入住武漢市中心醫院，患有嚴重的呼吸系統綜合症，包括發燒，頭暈和咳嗽。支氣管肺泡灌洗液樣本的宏基因組RNA測序鑑定出了冠狀病毒科的新型RNA病毒，在此稱為WH-Human-1冠狀病毒。對完整病毒基因組（29,903個核苷酸）的系統進化分析表明，該病毒與一組SARS樣冠狀病毒（Betacoronavirus屬，Sarbecovirus亞屬）最相似（89.1％核苷酸相似性）。這次疫情突出表明，病毒從動物身上溢出的能力正在引起人類嚴重疾病。
為了調查與該疾病相關的可能病原，我們收集了支氣管肺泡灌洗液（BALF）並進行了深轉錄組測序。 臨床標本在上海公共衛生臨床中心的生物安全3級實驗室中處理。通過基因對比測試，2019-nCoV與蝙蝠冠狀病毒bat-SL-CoVZC45的親緣關係最密切。
為了更好地了解WHCV感染人類的潛力，將其刺突蛋白的受體結合結構域（RBD）與SARS-CoV和蝙蝠SARS樣CoV中的受體結合結構域進行了比較。結果表明2019-nCoV可以有效地利用人ACE2作為細胞進入受體，從而潛在地促進人與人之間的傳播。
同時基因檢測也說明2019-nCoV存在基因重組，但沒有證據表明重組促進了WHCV的出現。
SARS和Zika等新型傳染病對公共衛生構成了重大威脅。儘管進行了廣泛的研究，但是如何，何時以及何地出現新疾病仍然是相當不確定。最近在中國湖北省武漢市報告了一種嚴重的呼吸系統疾病。自第一位患者於2019年12月12日住院以來，截至2020年1月25日，已報告至少1,975例病例。流行病學調查表明，此次爆發與武漢的海鮮市場有關。我們研究了一名在市場上工作的患者，該患者於2019年12月26日入住武漢市中心醫院，患有嚴重的呼吸系統綜合症，包括發燒，頭暈和咳嗽。支氣管肺泡灌洗液樣本的宏基因組RNA測序鑑定出了冠狀病毒科的新型RNA病毒，在此稱為WH-Human-1冠狀病毒。對完整病毒基因組（29,903個核苷酸）的系統進化分析表明，該病毒與一組SARS樣冠狀病毒（Betacoronavirus屬，Sarbecovirus亞屬）最相似（89.1％核苷酸相似性）。這次疫情突出表明，病毒從動物身上溢出的能力正在引起人類嚴重疾病。
研究的患者是一名41歲的男性，無肝炎，結核病或糖尿病病史。他於病發六天後即2019年12月26日在武漢市中心醫院就診並住院。患者在就診一周後報告發燒，胸悶，咳嗽，疼痛和無力（表1）。心血管，腹部和神經系統檢查均正常。觀察到輕度的淋巴細胞減少症（每立方毫米少於900個細胞），但在全血細胞計數（CBC）測試中，白細胞和血小板計數正常。在血液化學測試中，觀察到C反應蛋白（CRP，血液41.4 mg / L，參考範圍0-6 mg / L）升高，並且天冬氨酸轉氨酶，乳酸脫氫酶和肌酸激酶的水平略有升高。通過動脈血氣（ABG）測試，該患者患有輕度低氧血症，氧水平為67mmHg。在入院的第一天（發病後的第6天），胸部X線照片異常，並伴有空域陰影，如毛玻璃片混濁，兩個肺出現局灶性實變和斑塊狀實變（擴展數據圖1）。胸部計算機斷層掃描（CT）掃描顯示雙側局灶性實變，肺葉實變和片狀實變，特別是在下肺部。胸部X光片顯示入院後第5天（發病後第11天）雙側瀰漫性斑塊狀和模糊陰影。初步的病原學調查通過商業病原體抗原檢測試劑盒排除了流感病毒，肺炎衣原體和肺炎支原體的存在，並通過PCR進行了確認。其他常見的呼吸道病原體，包括腺病毒，也通過qPCR檢測為陰性（擴展數據圖2）。儘管進行了抗生素，抗病毒和糖皮質激素的聯合治療，但患者扔表現出呼吸衰竭，並接受了高流量無創供氧。治療三天後患者的病情沒有改善，他被送進了重症監護室（ICU）。該患者入院6天後被轉移到武漢的另一家醫院接受進一步治療。
表1：
擴展數據圖1：
擴展數據圖2
武漢市疾病預防控制中心（CDC）的流行病學調查顯示，該患者在當地的室內海鮮市場工作。 值得注意的是，除了魚類和貝類外，在暴發開始之前，市場上還出售各種活的野生動物，包括刺蝟，獾，蛇和鳥類（斑鳩），以及動物屍體和動物肉。 沒有蝙蝠出售。 儘管患者可能與市場上的野生動物接觸過，但他回憶說沒有接觸活禽。
為了調查與該疾病相關的可能病原，我們收集了支氣管肺泡灌洗液（BALF）並進行了深轉錄組測序。 臨床標本在上海公共衛生臨床中心的生物安全3級實驗室中處理。 從200μlBAL液中提取總RNA，並為雙末端（150 bp）構建一個元轉錄組文庫，用於成對末端（150 bp）測序，用於成對末端（150 bp）測序，如前所述。總共，我們產生了56,565,928個序列讀數，這些序列讀數從頭開始組裝並篩選潛在的病原體。在Megahit8組裝的384,096個重疊群中，最長的（30,474個核苷酸[nt]）具有很高的豐度，並且與蝙蝠SARS樣冠狀病毒分離株bat-SL-CoVZC45（GenBank登錄號MG772933）密切相關——先前在中國採樣， nt同一性為89.1％（補充表1和2）。分別通過RT PCR9和5'/ 3'RACE試劑盒（TaKaRa）確定並確認了這種新型病毒的基因組序列及其末端。將該新病毒命名為WH-Hunman-1型冠狀病毒（WHCV）（也稱為「2019-nCoV」），其整個基因組序列（29,903 nt）已傳至GenBank登錄號MN908947。針對WHCV的完整基因組重新映射RNA-seq數據獲得了123,613個讀段的組裝，提供了99.99％的基因組覆蓋率，平均深度為6.04X（範圍：0.01X -78.84X）（擴展數據圖3）。通過定量PCR（qPCR）估計BALF樣品中的病毒載量為3.95×108拷貝/ mL（擴展數據圖4）。
擴展數據圖3
擴展數據圖4
WHCV的病毒基因組組織的特徵是針對Beta冠狀病毒屬的兩個代表性成員的序列比對：人類起源的冠狀病毒（SARS-CoV Tor2，AY274119）和蝙蝠起源的冠狀病毒（Bat-SL-CoVZC45，MG772933）。
基於該序列比對和ORF預測，對WHCV的非翻譯區（UTR）和開放閱讀框（ORF）進行了定位。 WHCV病毒基因組類似於這兩種冠狀病毒（圖1和補充表3），基因順序為5'-複製酶ORF1ab-S-包膜（E）-膜（M）-N-3'。 WHCV具有典型的beta冠狀病毒的5'和3'末端序列，在5'末端有265nt，在3'末端有229nt。 預測的WHCV複製酶ORF1ab基因長度為21,291 nt，包含16個預測的非結構蛋白（補充表4），其次是（至少）13個下遊ORF。此外，WHCV與nsp1中的SARS-CoV共享一個高度保守的域（LLRKNGNKG：胺基酸122130）。 WHCV的S，ORF3a，E，M和N基因的預測長度分別為3,822、828、228、669和1,260 nt。除了由Sarbecovirus亞型的所有成員共享的這些ORF區域之外，WHCV與SARSCoV相似之處在於，它攜帶一個位於M和N的ORF基因之間的ORF8預測基因（長度為366 nt）。WHCV的ORF功能是根據已知的冠狀病毒預測的，並在補充表5中給出。以類似於SARS CoV Tor2的方式，可以很容易地在ORF的5'端上遊識別出一個前導轉錄調控序列（TRS）和九個假定的主體TRS，並且假定的保守TRS核心序列以兩種形式出現-ACGAAC或CUAAAC（補充表6）。
圖1
為了確定WHCV與先前鑑定的冠狀病毒之間的進化關係，我們基於整個基因組序列的核苷酸序列，非結構蛋白基因ORF1a和1b以及S，E，M和N編碼的主要結構蛋白，估算了系統發生樹（圖2和擴展數據圖5）。在所有系統發育中，WHCV都與Sarbecovirus亞類的成員聚集在一起，包括引起2002-2003年全球SARS大流行的SARS-CoV，以及從蝙蝠中取樣的許多SARS樣冠狀病毒樣本。但是，根據所使用的基因，WHCV改變了在Sarbecovirus亞屬內的拓撲位置，這暗示了這組病毒中過去的重組歷史（圖2和擴展數據圖5）。具體而言，在S基因樹中（擴展數據，圖5），WHCV與蝙蝠冠狀病毒bat-SL-CoVZC45的親緣關係最密切，胺基酸（aa）同一性82.3％（與SARS-CoV的胺基酸同一性77.2％；補充表3），而在ORF1b系統發生中，WHCV下降至輪狀病毒亞屬內的基礎位置（圖2）。在估計複製酶多蛋白pp1ab中保守結構域的系統樹中，也觀察到了這種拓撲劃分，可能反映了蝙蝠sarbecovirus病毒之間的重組（擴展數據圖6）。
擴展數據圖5
圖2
擴展數據圖6
為了更好地了解WHCV感染人類的潛力，將其刺突蛋白的受體結合結構域（RBD）與SARS-CoV和蝙蝠SARS樣CoV中的受體結合結構域進行了比較。WHCV的RBD序列與SARS-CoV的RBD序列更為相近（73.8％-74.9％胺基酸同一性），與SAS樣CoV也很相近，包括RB4874，Rs7327和Rs4231（75.9％-76.9％胺基酸同一性），這些都可以使用人ACE2受體進入細胞（補充表7）。此外，WHCV RBD僅比SARS-CoV RBD長一個胺基酸（擴展數據圖7a）。相反，與SARS-CoVs相比，包括不能使用人ACE2的Rp3株的其他蝙蝠SARS樣CoVs在473-477和460-472位具有胺基酸缺失（擴展數據圖7a）。先前確定的與人ACE2複合的SARS-CoV RBD的晶體結構（PDB 2AJF）顯示，區域473-477和460-472與人ACE2直接相互作用，因此在確定物種特異性中可能很重要（擴展數據圖7b）。我們使用SWISS-MODEL伺服器通過蛋白質同源性建模預測了WHCV，Rs4874和Rp3 RBD結構域的三維蛋白質結構，並將它們與SARS-CoV RBD結構域的晶體結構（PDB 2GHV）進行了比較（擴展數據圖7c- F）。與序列比對一致，WHCV和Rs4874 RBD結構域的預測蛋白質結構與SARS-CoV的蛋白質結構密切相關，並且與Rp3預測的RBD結構域的蛋白質結構不同。此外，WHCV S蛋白的N末端與SARS-CoV的N末端更相似，而非其他可以與唾液酸結合的人冠狀病毒（HKU1和OC43，擴展數據圖8））。 WHCV和SARS-CoV RBD結構域之間的胺基酸序列和預測的蛋白質結構表明，WHCV可以有效地利用人ACE2作為細胞進入受體，從而潛在地促進人與人之間的傳播。
擴展數據圖7
擴展數據圖8
為了進一步表徵輪狀病毒的進化史中的推定重組事件，使用了重組檢測程序v4（RDP4），分析了WHCV和四種代表性冠狀病毒的全基因組序列-蝙蝠SARS樣CoV Rp3，CoVZC45，CoVZXC21和SARS-CoV Tor2。儘管相似性圖表明WHCV和SARS CoV或SARS樣CoV之間可能發生重組事件（擴展數據圖9），但沒有顯著證據表明整個基因組都發生重組。但是，在WHCV、SARS CoV和蝙蝠SARS樣CoV（WIV1和RsSHC014）的S基因中檢測到一些過去重組的證據（p <3.147×10-3至p <9.198×10-9），具有相似圖提示在WHCV的S基因分為三個區域的核苷酸1,029和1,652處存在重組斷裂點（圖3）。在片段nt 1至1029和nt 1652到序列末端的系統發生中，WHCV與Bat-SL-CoVZC45和Bat-SL CoVZXC21密切相關，而在nt 1030至1651（RBD區域）區域中WHCV與可以直接人類傳播的SARS冠狀病毒以及蝙蝠SARS樣的冠狀病毒（WIV1和RsSHC014）密切相關。儘管這些重組事件在sarbecovirus病毒中似乎比較常見，但沒有證據表明重組促進了WHCV的出現。
擴展數據圖9
圖3
冠狀病毒與人類的許多傳染病暴發有關，包括2002/3年的SARS和2012年的MERS。其他四種冠狀病毒-人類冠狀病毒HKU1，OC43，NL63和229E-也與呼吸系統疾病有關。儘管自2005年以來在中國包括蝙蝠在內的哺乳動物中廣泛發現了SARS樣冠狀病毒9，但是人類感染的冠狀病毒的確切來源仍不清楚。本文中，我們從中國武漢市一名患有嚴重呼吸系統疾病的患者的BALF中描述了一種新型冠狀病毒-WHCV（2019-nCoV）。系統發生分析表明，WHCV是Betacoronavirus屬（Sarbecovirus亞屬）中的一種新型病毒，因此與SARS-CoV表現出一些基因組和系統相似性，尤其是在RBD中。這些與SARS的基因組上和臨床上相似性，以及其在臨床樣本中的大量存在，為WHCV與武漢市正在進行的呼吸道疾病爆發之間的關聯提供了證據。儘管僅從一名患者中分離出病毒不足以得出導致呼吸道症狀的結論，但我們的發現在其他患者中得到了獨立的證實。
蝙蝠中多種SARS樣冠狀病毒的鑑定導致人們認為這些動物是這些病毒的天然宿主。儘管在中國的蝙蝠中已廣泛識別出SARS樣病毒，但尚未記錄與SARS-CoV相同的病毒。值得注意的是，WHCV與蝙蝠冠狀病毒最密切相關，甚至在nsp7和E蛋白中與Bat-SL-CoVZC45表現出100％的胺基酸相似性。因此，這些數據表明蝙蝠可能是WHCV的宿主。但是，由於首次報告該病時市場上有多種動物在出售，因此需要更多的工作來確定WHCV的天然宿主和任何中間宿主。