2013年年底，結構生物學經歷了一場「解析度革命」，許多生物大分子的神秘面紗紛紛被揭開。冷凍電子顯微鏡（以下簡稱「冷凍電鏡」）是結構生物學的重要研究工具、重要突破，其結構解析的解析度已從納米尺度進入埃尺度（即原子尺度），成為可以與X射線晶體學相媲美的結構解析方法。其中，單顆粒冷凍電鏡技術大大降低了結構解析的難度，提高了結構解析的速度。通過冷凍電鏡技術，研究人員可以揭示許多之前未能知曉的生物分子細節，幫助人們揭秘眾多的生物學現象。
文/張凱銘 李珊珊
2020年，在新型冠狀病毒（以下簡稱「新冠病毒」）基因序列公布之後的幾個月內，重組表達的刺突糖蛋白、核蛋白的部分結構已被解析。然而，完整的病毒結構、結構蛋白在病毒上的原位全長結構、分布規律、拷貝數及與其他結構蛋白的相互關係仍然是迷霧。2020年8月至9月間，英國劍橋大學、德國馬克斯普朗克研究所、清華大學的研究人員相繼解析了新冠病毒原位結構，讓大家清楚看到真實的病毒形象。我們課題組藉助冷凍電鏡技術，在透射新冠病毒的結構和解析解析度上實現了重大突破，在推進冷凍電鏡技術革新的同時，也協同促進結構病毒學的發展。
解析Anti-CRISPR對Csy複合物的抑制機制
截至目前，研究人員已經鑑定出多種Anti-CRISPR蛋白。其中，最早被研究人員鑑定出的Anti-CRISPR蛋白作用於I-F型CRISPR-Cas系統（I-F型CRISPR-Cas系統也被稱作Csy複合物）。已有研究對Csy複合物中的AcrF1、AcrF2、AcrF10蛋白結構以及對應的抑制機制進行了闡述，但是其他類的Anti-CRISPR蛋白，如AcrF9、AcrF8和AcrF6識別並抑制CRISPR-Cas系統的機制尚不清楚。
我們課題組與哈爾濱工業大學生命科學學院黃志偉教授課題組合作，通過冷凍電鏡技術揭示了AcrF9、AcrF8和AcrF6對Csy複合物的抑制機制。相關研究成果於2020年3月31日發表在《美國科學院院刊》（PNAS）上。
藉助單顆粒冷凍電鏡技術，我們共同解析了AcrF9、AcrF8、AcrF6與Csy複合物的結構，解析度分別為0.257納米、0.342納米、0.315納米。其中，解析度為0.257納米的Csy-AcrF9複合物結構揭示了Csy複合物在近原子級別上相互作用的結構細節，並首次顯示部分區域內存在水分子的相互作用（見圖1）。通過類似的結構生物學以及體外活性檢測實驗，我們發現，AcrF8與Csy複合物螺旋骨架上的不同位置結合併與crRNA相互作用，從而抑制crRNA對DNA底物的識別。與前兩者不同，AcrF6與Csy的Cas7.6f和Cas8f亞基之間的交界處結合，從而抑制了DNA雙鏈解旋。這一研究成果為深入了解Anti-CRISPR蛋白對Csy複合物的抑制機制以及設計靶向Csy複合物的基因編輯工具提供了結構基礎。
解析miRNA加工過程中的重要機制
miRNA是一類重要的基因表達調控因子，在細胞發育、分化、衰老等生物學過程中發揮著至關重要的作用。起初，miRNA在細胞核中是一種微小的摺疊髮夾結構，被稱為初始miRNA（pri-miRNA）。pri-miRNA是伴隨基因組DNA的轉錄而產生的長度為數千個鹼基的miRNA，其核心部分為莖環結構，而發揮功能的區域處於莖環結構的雙鏈區。細胞藉助「微處理器」複合物來識別並加工pri-miRNA，最終形成成熟的miRNA。其中，「微處理器」複合物包含1個Drosha和2個DGCR8蛋白，Drosha是核心催化組分，DGCR8為雙鏈RNA結合蛋白，負責招募pri-miRNA底物。Drosha會切割pri-miRNA的基底部，生成miRNA前體（pre-miRNA）。隨後，miRNA前體再經細胞質內的加工形成成熟的miRNA。成熟的miRNA及RNA誘導沉默複合物（RISC）與細胞質中的信使RNA（mRNA）相互作用，抑制翻譯過程，阻止蛋白質的生成。儘管對miRNA加工過程已有研究，但對「微處理器」的蛋白結構仍然知之甚少，需要進一步地研究去了解miRNA的功能和調控機制。
基於此，我們課題組對miRNA加工機製做了進一步解析。結果顯示，Drosha/DGCR8複合物通過內部的多種結構域協作特異性識別並精確加工pri-miRNA，完成對miRNAs的核內加工過程。相關研究成果於2020年5月7日發表在《分子細胞》（Molecular cell）雜誌上。
在該研究中，我們解析了pri-miRNA處於部分結合以及完全結合狀態下的兩個結構。當Drosha的螺旋帶（HB）結構域翻轉，並與Drosha的C-端結構域、楔形結構域、RNA結合結構域緊密結合後，pri-miRNA會從部分結合狀態轉變成全結合狀態。Drosha和DGCR8的雙鏈RNA結合結構域（dsRBD）鎖定在長度約35 bp的pri-miRNA雙鏈莖部結構區域內，而DGCR8的血紅素結合域（HBD）則圍繞pri-miRNA的頂環結構內，這樣可以促使Drosha/DGCR8複合物特異性識別pri-miRNA。RIIIDa和RIIIDb催化區域與pri-miRNA的莖部雙鏈區結合，pri-miRNA的底部雙鏈RNA、游離單鏈RNA由Drosha的螺旋帶狀結構域和楔形結構域圍繞。
RNA三維結構的快速測定
作為「中心法則」的中間分子，RNA一般被摺疊成複雜的三維結構以維持自身的穩定性，在無須依賴其他蛋白的前提下，RNA可參與基因轉錄、催化反應等生物學過程。人類基因組的80%會被轉錄為RNA，但是僅有1.5%的RNA編碼蛋白質。目前，在蛋白資料庫中解析的RNA結構不足1500個，主要是通過X射線晶體學和磁共振獲得的。然而，RNA分子構象的異質性較大，尤其是在缺乏蛋白因子的情況下，X射線晶體學和磁共振這些傳統技術難以確定RNA的結構。冷凍電鏡技術的迅速發展推動了結構生物學的進步。其中，單顆粒冷凍電鏡技術在重構蛋白、RNA方面優於傳統技術。然而，因RNA分子通常太小且構象不均一，使用單顆粒冷凍電鏡技術來解析純RNA結構的進展相對緩慢。目前，已有研究顯示，解析度高於1納米的純RNA冷凍電鏡結構僅有1個。
就如何快速解析RNA分子的冷凍電鏡結構，我們經過不斷地嘗試得到一種可以準確並快速獲得高解析度的純RNA分子結構的突破性方法——Ribosolve，破解了RNA分子結構解析的難題。相關研究成果於2020年7月3日發表在《自然方法》（Nature Methods）雜誌上。
Ribosolve整合冷凍電鏡、生化方法M2-seq和計算機建模工具auto-DRRAFTER於一體，對RNA的結構進行高解析度解析。具體而言，我們首先通過冷凍電鏡技術解析中等解析度的RNA結構，然後通過M2-seq方法精確測定RNA的二級結構，最後藉助計算機建模工具auto-DRRAFTER進行建模。從時間上來說，Ribosolve可以在較短的時間內快速解析RNA結構。基於Ribosolve，我們共解析11個RNA結構，鹼基長度在60 nt與400 nt之間，包括核糖開關（riboswitch）、核酶（ribozyme）和人工合成的RNA。雖然通過Ribosolve解析的RNA結構的解析度未達到原子級別，但可以呈現出解析度在0.10～0.47納米的RNA分子的整體三維結構。基於此，研究人員可以分析RNA與其他因子結合引起的構象變化，並驗證已預測的RNA結構的準確性。總之，Ribosolve為RNA及類似結構的解析提供了新的研究方向，打破了傳統技術在結構解析方面的限制。
解析分子量最小的RNA結構
冷凍電鏡技術在解析新冠病毒方面也發揮了重要作用，成為研究病毒結構與功能的重要技術手段。許多新冠病毒蛋白的三維結構已經被解析，大大促進了靶向藥物的研發進程。然而，我們對冠狀病毒的了解還很有限，尤其是對RNA結構的認識還遠遠不夠。與其他RNA病毒一樣，新冠病毒RNA的結構對調節病毒複製、基因表達至關重要。儘管最近有研究人員發表了新冠病毒基因組與轉錄組數據，但目前針對新冠病毒中RNA結構的預測數據相對較少，而大多推測的調控序列還尚未被鑑定。
已有研究顯示，新冠病毒的5'UTR、3'UTR和移碼刺激元件（FSE）在病毒複製周期中起到至關重要的作用。FSE在開放閱讀框ORF1a/ORF1b邊界附近，可以使核糖體移碼1個鹼基，從而使其繞過ORF1a末端的終止密碼子，進入ORF1b繼續編碼蛋白。病毒的RNA依賴性RNA聚合酶（RdRP）就是靠這種方式編碼的。然而，FSE的三維結構尚不清楚，作用的分子機制也不明確。
我們課題組藉助冷凍電鏡和Ribosolve解析了大小為28 kDa（長度為88 nt）的FSE結構，解析度達0.69納米，這是目前由單顆粒冷凍電鏡技術獲取的分子量最小的亞納米級解析度的生物分子結構。相關研究成果於2020年7月20日公布在生物研究預印本在線期刊BioRxiv上。
我們首先通過體外實驗抑制FSE介導的核糖體移碼活性。結果顯示，反義寡核苷酸（ASO）可以抑制新冠病毒FSE介導的核糖體移碼，影響新冠病毒在細胞內的複製。然而，ASO並不能完全抑制FSE活性。為了解決當前的局限性，我們通過冷凍電鏡技術和Ribosolve來確定新冠病毒FSE的三維結構，並通過RNA納米結構標記方法對其進行驗證。起初，我們獲得解析度為0.69納米的FSE解析結構，但是這個解析度不足以分析鹼基之間的相互作用。此外，在分析冷凍電鏡數據的過程中，許多高異質性的構象會被過濾，得到的信息並不是完整的。為了獲得精度更高、信息更全面的FSE結構，我們進一步使用Ribosolve來模擬RNA的三維結構，進而得到具有複雜分子摺疊的解析度為0.59納米的拓撲結構，其5'端穿過由3個莖環形成的中心孔洞，可能為重要的靶點區域。該研究揭示了新冠病毒基因組裡面重要元件FES的三維結構，並為闡述功能的分子機制提供了結構基礎。
解析Alpha-冠狀病毒HCoV-NL63刺突糖蛋白原位結構
Alpha-冠狀病毒HCoV-NL63是一種有膜包被且在自然界中廣泛存在的病毒。據統計，每年引起呼吸道疾病的病原體中約有10％為HCoV-NL63，與嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒（SARS-CoV-1）和新冠病毒類似，HCoV-NL63也是以血管緊張素轉化酶2（ACE2）為受體感染人體，利用從病毒囊膜突出的刺突糖蛋白三聚體與ACE2結合，進而介導病毒與人體融合。
病毒表面的刺突糖蛋白是中和抗體的主要靶標，對疫苗設計和藥物結構優化的研究至關重要。每個刺突糖蛋白包含2個區域：處於N-末端的S1亞基（負責與受體結合）；處於C-末端的S2亞基（介導單跨膜螺旋將刺突糖蛋白固定在病毒包膜上）。一旦刺突糖蛋白的S2亞基位點被宿主跨膜絲氨酸蛋白酶裂解而激活，刺突糖蛋白會從融合前構象轉變到融合後構象。已有研究揭秘了純化後的融合前刺突糖蛋白的胞外域結構，其結果顯示S1亞基具有構象異質性及多個糖基化位點。
我們課題組藉助單顆粒冷凍電鏡技術從無化學固定劑的病毒體表面直接挑取刺突糖蛋白顆粒，經過三維重構，以0.34納米的解析度展示了HCoV-NL63刺突糖蛋白三聚體的原位結構，並清楚地看到蛋白表面的糖基化密度。這種結構為將來研究處於天然狀態下的冠狀病毒刺突糖蛋白與受體、抗體或藥物結合研究奠定了基礎。相關研究成果於2020年11月17日發表在《生物學評論季刊》（QRB discovery）上。
與新冠病毒相比，HCoV-NL63 S1亞基具有1個額外的N-末端結構域，該域被認為是Alpha-冠狀病毒的典型特徵。新冠病毒的受體結合結構域（RBD）具有一定的靈活性，在向上（開放）和向下（閉合）構象之間轉換，ACE2能夠結合RBD的向上構象以啟動病毒與受體的結合，而HCoV-NL63的RBD與結構域A相互作用，穩定在HCoV-NL63 S1亞基的閉合「圓圈」中。因此，HCoV-NL63 RBD上的3個受體結合基序（RBMs）被掩埋在結構域A和RBD之間的界面中，防止RBMs與ACE2的結合。此外，我們將HCoV-NL63和新冠病毒中的S2亞基結構進行了疊加，結果顯示兩者的S2亞基結構具有一致性。
利用標準配置的冷凍電鏡獲取原子解析度的載鐵蛋白結構
單顆粒冷凍電鏡技術在解析膜蛋白和大型蛋白複合物結構方面已成為首選方法。然而，對藥物的精確設計，則需要我們知曉精細的化學組成，由此要求結構的解析度要達到原子級別（優於0.15納米）。
我們課題組利用標準配置的冷凍電鏡300 kV Titan Krios G3i結合K3（Gatan）或Falcon4相機獲得解析度分別為0.134納米和0.136納米的載鐵蛋白結構。相關研究成果於2020年11月2日發表在《細胞研究》（Cell Research）雜誌上。
該研究結果顯示，具有原子級別解析度的冷凍電鏡結構清晰地展示了胺基酸側鏈中的每個重原子（如C、N、O和S），並隱約可以看到氫原子的存在和位置。此外，我們還發現了某些殘基具有多個旋轉異構構型。在該研究中，我們更新了Q-score系統，使其適用於解析度可達0.1納米的結構數據。利用改進後的Q-score系統，我們對解析度在0.101納米和0.175納米之間的載鐵蛋白結構的可解析性進行了系統評估，結果顯示，利用標準配置的冷凍電鏡獲得的載鐵蛋白結構與其他近似解析度的載鐵蛋白結構相比具有同等的解析度。此外，我們還開發並改進了用於評估電鏡結構質量的方法：水分子定位以及B』因子。其中，B』因子可以用於評估電鏡結構中原子位置的不確定度，基於模型利用此因子可以計算得到一個與實驗數據相同的結構。
張凱銘，美國史丹福大學生物工程系研究員，致力於利用冷凍電鏡技術解析生物大分子結構，揭秘生物分子相互作用的細節。
李珊珊，美國史丹福大學生物工程系研究專員，致力於生物大分子結構的解析研究。
張凱銘將任職於中國科學技術大學特任研究員、博士生導師，獲得中科院「率先行動」計劃資助。課題組將利用冷凍電鏡技術開展與重大疾病（如癌症、COVID-19、愛滋病）相關的RNA和RNA-蛋白複合物的結構研究，以助力開發和設計藥物分子。同時，將開發利用冷凍電鏡解析小分子量樣品的方法，為快速藥物篩選和開發提供平臺。現擬招聘博士後1-2名，科研助理（實驗室管理員）1名。博士後崗位待遇：根據中國科學技術大學博士後管理相關規定執行，包括工資、津貼、住房和子女入學入託等。優秀者在聘期結束後將進一步支持其事業發展。科研助理（實驗室管理員）崗位待遇：參照中國科學技術大學項目聘用待遇，具體面談，相關福利待遇按學校政策執行。有意向者請將簡歷（包括兩封推薦信或兩位推薦人的姓名和詳細聯繫方式）發送至kmzhang@stanford.edu 或kaimingzhang11@gmail.com，郵件註明「應聘」。