引用本文：何納, 陸一涵, 李立明, 沈洪兵, 楊維中, 馮子健, 國家自然科學基金新冠應急專項課題協作組. 新型冠狀病毒無症狀感染的流行病學研究設計[J]. 中華流行病學雜誌, 2020年第41卷[網絡預發表].DOI:10.3760/cma.j.cn112338-20200723-00975
作者：何納，陸一涵，李立明，沈洪兵，楊維中，馮子健，國家自然科學基金新冠應急專項課題協作組
摘 要
新型冠狀病毒可引起新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）。患者是主要傳染源，但無症狀感染者也可能成為傳染源，且引起社區傳播的風險更大。目前，關於人群中無症狀感染率及其傳染性尚無定論。本研究設計選取COVID-19疫情高發與低發地區作為研究現場，對社區人群和重點人群（包括COVID-19治癒病例、確診病例的密切接觸者、醫護人員/CDC流行病學調查人員、發熱門診患者）開展流行病學問卷調查、血清抗體和核酸檢測，確定不同人口社會學特徵和暴露風險人群的新型冠狀病毒無症狀感染率，及其流行病學特徵；對確診病例和無症狀感染者開展流行病學隨訪，分析血清抗體水平變化，評估傳染性和傳播風險。
【關鍵詞】新型冠狀病毒；新型冠狀病毒肺炎；無症狀感染；血清流行病學
前 言
2020年3月11日，WHO宣布新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）疫情形成「全球大流行」[1]。截至6月底，全球COVID-19確診病例數超過一千萬例，嚴重影響了公共衛生與全球衛生安全[2]。
本次疫情中，中國最早定義無症狀感染者，即「無臨床症狀，但呼吸道等標本新型冠狀病毒（新冠病毒）病原學或血清特異性IgM抗體檢測呈陽性者」[3]。中國CDC的分析結果顯示，截至2月17日報告的全國病例數據中，無症狀感染者比例約為1.2%[4]。2月19日，國家衛生健康委員會發布《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）》，首次指出COVID-19患者是主要傳染源，但無症狀感染者也可能成為傳染源[5]。然而，由於檢測策略的問題，無症狀感染者通常僅在具有明顯流行病學關聯性時才可能接受實驗室檢測與影像學檢查，進而被識別和診斷，包括密切接觸者的醫學觀察，聚集性疫情的調查，傳染源的追蹤和部分有境內（外）COVID-19持續傳播地區旅遊史/居住史人員的檢測。由此可見，此類感染者難以及時發現和診斷，從而隱匿於社區導致疫情防控難度加大。一項數學模型研究利用1月10-23日的中國疫情數據進行模擬，估算出高達86%的感染者未被確診，其中大多數可能為輕症或無症狀感染者；如果這些感染者都被識別，則可能減少79%的有症狀感染[6]。無症狀感染者可能是疫情蔓延的嚴重隱患。
為全面地了解無症狀感染者的真實比例，需要通過實驗室檢測來進行確證。2020年1月底，日本報告從中國湖北省武漢市撤僑人員565人中，8人為核酸陽性，其中5人為無症狀感染者（0.9%）[7]。2020年5月14日至6月1日，武漢市採用混合檢測方法集中檢測核酸（9 899 828人），發現無症狀感染者300人（0.303/萬）[8]。然而，上述核酸檢測方法耗時耗力，相比之下血清抗體檢測可能更為便捷、且更能代表人群感染情況。目前，僅有少數研究估算一般人群（無COVID-19相關症狀）的新冠病毒抗體陽性率。針對從中國湖北省返回中國香港地區（452人）和美國洛杉磯（863人）居民的研究發現，無症狀人群的新冠病毒抗體陽性率分別為3.8%和4.1%，實際感染（或曾經感染）新冠病毒但卻未被識別的比例可能達97%~98%[9-10]。上述研究結果表明，通過血清抗體檢測也可以較好地識別人群感染新冠病毒的水平，從而幫助判斷無症狀感染發生的比例。
目前，針對COVID-19無症狀感染者的流行特徵和傳播途徑等仍缺少相關的信息和研究數據；而且，根據傳染病流行的規律，疫情高發（如武漢市）和低發（湖北省以外省份）地區人群中的無症狀感染比例也可能不同。因此，在我國前一階段防控COVID-19疫情取得階段性成效，但下一階段疫情走向尚不明朗的情況下，亟待開展全國範圍內、全面系統的新冠病毒無症狀感染流行病學研究，為優化和完善疫情防控措施提供決策依據，鞏固當前的疫情防控成果，阻止潛在的疫情反彈和擴散趨勢。
一、研究設計目的
首先採用橫斷面研究，通過檢測社區人群新冠病毒血清抗體、重點人群新冠病毒血清抗體和病毒核酸，調查不同暴露風險人群的新冠病毒感染率；然後採用前瞻性隨訪，調查重點人群新冠病毒感染者特別是無症狀感染者的血清抗體水平的變化情況。
二、研究對象與方法
1. 調查對象與抽樣方法：擬在湖北省武漢市、湖北省除武漢市之外所有地市，以及北京市、上海市、江蘇省、廣東省、四川省和遼寧省進行，分別調查社區人群和重點人群。
社區人群調查採用分層、兩階段、整群、隨機抽樣方法，首先根據不同地區進行分層，然後分別整群抽取調查社區（第一階段）和調查戶（第二階段），將抽中調查戶的家庭成員全部納入調查：
（1）武漢市所有縣區：以各縣區所有社區（居委會或村委會）作為抽樣框，按照PPS方法選擇100個社區，每個社區隨機抽取36戶。按照平均每戶3人計算，武漢市共調查6 000~8 000人。
（2）湖北省除武漢市以外的16個地市：每個地市內，按照縣區COVID-19累計報告發病率排序，通過系統抽樣原則確定抽樣間隔，從累計發病率最高縣區開始選取3個縣區（神農架林區選擇3個鄉鎮），即轄區內高、中、低發病率水平的縣區各1個；在每個選擇的縣區內，按照PPS方法選擇5個社區，每個社區隨機抽取15戶。因此，每縣區調查≥200人，每地市調查≥600人，共調查≥9 600人。
（3）按照COVID-19累計報告發病率水平，在全國選擇北京市、上海市、廣東省、江蘇省、四川省、遼寧省開展調查。各省內，按縣區COVID-19累計報告發病率排序，通過系統抽樣原則確定抽樣間隔，從累計發病率最高縣區開始選取4個縣區，並在省內零病例報告縣區中隨機選擇1個縣區；在每個選擇的縣區內，按照PPS方法選擇5個社區，每個社區隨機抽取25戶。因此，每縣區調查≥360人，每個省調查≥1 800人，共調查約10 800人。
社區調查對象為2020年1-3月期間在本地持續居住時間≥14 d的≥1歲常住人口。此部分抽樣以戶為單位，其年齡構成可能因為失訪、拒訪等原因導致某年齡組樣本過少，則以縣區為單位，在調查社區內按隨機原則增加抽樣戶，補齊相應年齡組樣本，保證與人群自然年齡結構相似。相應人群年齡組參考比例及建議控制比例見表1。
重點人群採用方便抽樣的方法進行調查，包括COVID-19治癒病例、COVID-19確診病例的密切接觸者、直接診治確診病例的醫護人員、直接面對確診病例的CDC流行病學調查人員、排除新冠感染的發熱門診就診病例。上述各區域分別調查800人，每類重點人群的調查數量按當地實際情況自行調整。
2. 基線調查：遵循知情自願的原則。調查員說明研究具體目的、內容、方式、益處和風險，調查對象（或監護人）充分理解後籤署知情同意書。如調查對象不識字或不能籤字，可在調查對象同意的前提下由他人代籤，並同時在知情同意書上簽署代籤人的名字。調查員按照統一的調查問卷，詢問和收集以下信息：
（1）人口社會學特徵：性別、出生年月、文化程度、職業、家庭經濟收入水平等。
（2）個人健康信息：既往疾病史、傳染病發病史、近期是否有呼吸道/消化道症狀出現、呼吸道病原體疫苗接種史等；針對重點人群，收集CT檢查結果。
（3）本次COVID-19疫情期間的可能暴露史：重點地區旅行/居住/工作史、確診/疑似病例接觸史、野生動物養殖/食用/接觸史等。對於COVID-19治癒病例及入院診療的無症狀感染者，同時收集疾病發生發展過程和臨床診療數據，包括CT檢查結果等。
3. 隨訪：針對血清抗體檢測陽性的重點人群開展隨訪，隨訪期為6個月；但各調查區域可根據當地實際情況，適當增加隨訪頻次（例如2個月1次）。在隨訪期間，基於《新型冠狀病毒感染的肺炎可疑暴露者和密切接觸者管理方案（第三版）》，設計隨訪調查表，定期收集調查對象的暴露史變化情況、發熱和其他不適症狀/體徵、醫療機構就診經歷、臨床檢查與實驗室檢測的相關結果、治療用藥情況等。
4. 標本採集與實驗室檢測：
（1）標本採集：採集調查對象的非抗凝血標本（≤5歲採集3 ml，＞5歲採集5 ml）。重點人群基線調查與隨訪時，同時採集鼻咽拭子（如調查對象無法配合，則採集口咽拭子）。鼻咽拭子採樣時拭子通過鼻腔輕輕、緩緩插入拭子至鼻咽部，停留數秒吸取分泌物，然後輕輕旋轉取出拭子，浸入病毒運送液（需2份）；口咽拭子採用軟棉籤擦拭兩側顎弓和咽、扁桃體上的分泌物後，採用專業的病毒採樣管保存（需2份）。
選擇有運輸感染性物質資質的公司，在採樣後4 h內將採集標本運輸至指定生物安全實驗室。血標本按標準方法離心，分離血清並分裝2管，A管（檢測管）於4℃保存待檢，並在2 d內完成檢測；B管（儲備管）於-40°C冷凍保存備用。鼻咽拭子/口咽拭子標本按常規方法處理，在56℃ 30 min滅活後，於-20℃冷凍保存待檢測。
（2）病毒核酸檢測：統一使用獲得藥監局註冊證的核酸檢測試劑盒進行螢光定量RT-PCR，分別檢測新冠病毒核酸ORF1 a/b和N基因片段。
如果病毒核酸檢測結果為陽性，則按照《新型冠狀病毒肺炎防控方案（第六版）》、《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》等文件的要求[3, 11]，立即進行相應處置。
（3）血清抗體檢測：統一使用獲得藥監局註冊證的抗體檢測試劑盒，檢測血清新冠病毒的IgM、IgG或總抗體。同時使用2種不同檢測原理或包被不同重組蛋白的檢測試劑，進行平行檢測，其中任一檢測結果為陽性即判定為陽性。所有檢測結果陽性的標本送中國CDC病毒病所進行微量中和試驗覆核。
同時，各調查區域可根據當地實際情況，自主考慮檢測甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、博卡病毒等呼吸道病毒的核酸或IgM/IgG抗體。
（4）無症狀感染者識別：在上述調查和實驗室檢測中，如果發現病毒核酸和/或血清IgM抗體陽性，且無發熱和/或呼吸道症狀、無影像學特徵、無白細胞總數降低/淋巴細胞計數減少，則判定為無症狀感染者[3]。
5. 數據錄入與管理：
（1）數據錄入：通過EpiData軟體，分別建立調查問卷與實驗室檢測的資料庫，並由雙人錄入結果。調查問卷錄入工作在調查結束後1周內完成，實驗室檢測結果錄入工作在2 d內完成。
（2）數據管理：上述調查問卷與實驗室檢測資料庫建立後，由專人將2個資料庫匹配連接，並添加入總資料庫。由研究項目組統一管理訪問資料庫的權限。
6. 質量控制：
（1）流行病學調查：組織有現場流行病學調查經驗的CDC和社區衛生服務中心工作人員擔任調查員，並統一進行培訓。調查員通過面訪方式，填寫調查問卷。每次調查結束後，由專人檢查問卷內容有無缺失。數據分析啟動後，通過邏輯校對及時回顧調查問卷填寫質量，並進行修正。隨機抽取10%（社區人群）和5%（重點人群）的調查對象，重複調查問卷中的核心內容，核對2次調查內容的一致性。
（2）生物標本採集和保存：組織經驗豐富的醫療機構臨床醫護人員採集生物標本，並統一進行培訓。每次採樣和實驗室分裝結束後，由專人檢查標本管標記和標本送檢單。隨機抽取20%的調查地點，現場監督和評價採樣流程和操作步驟。
（3）實驗室檢測：統一使用獲得藥監局註冊證的試劑盒，嚴格按照說明書進行操作，按照國家標準進行質控。每次檢測結束後，由專人檢查實驗室原始記錄。將各省所有新冠病毒核酸和抗體檢測陽性標本，以及隨機抽取的50份陰性標本均需送中國CDC病毒病所進行覆核。
（4）數據錄入：資料庫錄入由雙人進行，並進行交叉比對。隨機選取10%的錄入記錄，與原始調查問卷和實驗室檢測記錄進行比對。
7. 統計學分析：
（1）採用描述性統計方法，分析調查對象的人口社會學特徵、個人健康信息、COVID-19疫情期間的暴露史，以及新冠病毒核酸和血清抗體、其他呼吸道病毒抗體的檢出率。
（2）採用logistic回歸，分析上述指標相互之間的關聯性。
（3）採用描述性統計方法，分析重點人群血清抗體變化情況；並根據檢測數據的實際情況，考慮採用生存分析或重複測量分析，探索抗體變化規律。
三、技術路線圖（圖1）
四、討 論
目前，新冠病毒無症狀感染者有2種情形：一是經14 d的隔離醫學觀察，均無任何可自我感知或可臨床識別的症狀與體徵，即真正的「無症狀感染」（asymptomatic case），也可稱為隱性感染者；值得注意的是，部分隱性感染者雖無臨床症狀/體徵，但存在影像學改變[12]。二是感染者被識別、診斷時處於潛伏期，一旦進入臨床症狀期後可表現出症狀與體徵，即潛伏期感染（pre-symptomatic case）。上述2種無症狀感染者與輕症感染者（pauci-symptomatic case）存在區別，後者表現為症狀極為輕微或者不典型。然而，當前新冠病毒無症狀感染者的研究較少，結果也存在一定的差別。在一項針對美國華盛頓州某養老院的小樣本量調查中發現，有症狀感染率為13.2%、無症狀感染率為17.1%（76人）[13]。而在「鑽石公主號」郵輪疫情中，3 711名乘客和船員接受為期2周的隔離後，共有634人檢出新冠病毒，其中無症狀感染者為328例（8.8%）；進一步利用貝葉斯數學模型進行擬合，估計無症狀感染者比例為17.9%[14]。需要注意的是，上述研究均以老年人群為主，且都採用核酸檢測方法，因此其感染率可能偏高。中國浙江省研究報導，兒童中的無症狀感染率為27.8%（36人）[15]，提示需要進一步分析和比較不同人口社會學特徵群體的新冠病毒感染率及其流行病學特徵。在另一項研究中，中國香港大學針對「鑽石公主號」郵輪上215名中國香港籍居民返回中國香港地區後進行隨訪，結果發現9人為新冠病毒核酸/抗體陽性；其中，6人全病程周期均無臨床症狀，另3人存在肺部CT改變，提示血清抗體檢測也適用於無症狀感染者的識別[12]。
目前，我國疫情防控已進入相對平穩時期。2020年2月下旬開始，湖北省外各地區開始復工、復產，3-4月期間逐漸復學，疫情防控重點轉為境外輸入性病例。然而，6月11日，北京市確認發生源自新發地市場的聚集性傳播，截至7月3日，共報告新發病例332例，其中包含多名無症狀感染者[16]，再次表明無症狀感染者對於COVID-19疫情防控的重要流行病學意義。因此，選取COVID-19疫情高發與低發地區作為研究現場，通過現場調查和實驗室檢測，可確定具有不同暴露風險的社區人群與重點人群的新冠病毒感染率，分析感染者特別是無症狀感染者的流行病學分布特徵，以及感染與暴露風險的關聯性；還可建立基於重點人群的研究隊列，隨訪觀察感染者特別是無症狀感染者血清抗體水平的變化情況，並比較其與顯性感染者（COVID-19治癒病例）的差異，評估其傳染性和傳播風險，從而系統研究不同地區、不同人口社會學特徵、不同暴露風險人群的新冠病毒感染過程及其流行病學分布特徵，觀察其發病自然史。而基於全球目前研究成果的綜述表明，無症狀感染者的傳播效力仍未可知[17]，因此，通過重點分析無症狀感染的流行病學特徵和可能傳播風險，從而在當前「內防擴散，外防輸入」的防控策略指導下，儘可能識別本地無症狀感染者和傳播高風險人群，可為未來的疫情精準防控提供科學依據。
利益衝突所有作者均聲明不存在利益衝突
國家自然科學基金新冠應急專項課題協作組中國醫學科學院王辰、楊維中、馮錄召、冷志偉；武漢市CDC何振宇、王夏、郭燕、張志峰、劉滿清；中國醫學科學院病原生物學研究所任麗麗、郭麗；中國CDC高福、馮子健、李中傑、羅會明、秦穎、安志傑、馬超、向妮娟；中國CDC病毒病所許文波、毛乃穎；中國CDC傳染病所餘建興；湖北省CDC官旭華；湖北省宜昌市CDC劉建華；北京大學公共衛生學院李立明、高文靜；北京市CDC王小莉、崔淑娟、張奕、鄭陽、王全意；遼寧省CDC姚文清、毛玲玲、王子江、孫英偉；復旦大學公共衛生學院何納、陸一涵；上海市CDC孫曉冬、潘浩、吳琳琳；南京醫科大學公共衛生學院沈洪兵、宋詞；江蘇省CDC武鳴；廣東省CDC宋鐵、康敏、莊雅麗、李柏生；南方醫科大學公共衛生學院楊杏芬、毛琛；四川省CDC吳先萍、毛素玲、周久順、袁珩、潘明；四川大學公共衛生學院許欣
參考文獻略
轉載自：中華流行病學微平臺