【原料】滇山茶花提取物----一種多效抗衰老的植物活性原料

▇ 昆明仟草生物科技有限公司 黃燦 呂妍

摘要:本文介紹了滇山茶花作為雲南特有的植物資源，其藥用歷史悠久。我們採用超聲低溫提取結合柱色譜分離技術獲取滇山茶花特定的活性部位。通過體外實驗證實滇山茶花提取物在抗氧化、抑制透明質酸酶和抑制酪氨酸酶三個方面均顯示出優秀的活性，是潛在的多效抗衰老植物活性原料。

關鍵詞: 滇山茶花提取物；多效抗衰老；抗氧化；保溼；美白；安全性能

引言

在生活方式改變和環境因素惡化的雙重作用下，抗衰老產品在亞洲越來越備受青睞。逐漸跨越品類和消費群體年齡的限制。英國市場研究諮詢公司Mintel的分析人員最近也指出多功能跨品類抗衰老產品將越來越多。同時具備美白、抗衰老、保溼宣稱的產品所佔比重也在逐年上升，而從植物中篩選出同時具備上述多種活性的天然成分將為下遊新品開發提供有效的物質支撐。我們的研發人員發現滇山茶花提取物在該方向顯示了很好的應用前景。

山茶屬植物，原產亞洲，近80%的山茶品種出自中國，雲南作為中國茶花的產地，被認為是世界山茶科植物的發祥地[1]。在雲南眾多的山茶品種中，以滇山茶最為享負盛名，並於1983年被定為雲南省省會——昆明的市花，位列雲南八大名花之首。

滇山茶歷史悠久，當地人對滇山茶花的喜愛不僅源於它的觀賞價值與精神隱喻，更出於其作為中蒙藥在醫學領域的重要藥用價值。民間偏方記載，滇山茶具有涼血、止血、調經等功效，用於治療鼻衄（即鼻出血）、崩漏（即婦女非周期性子宮出血）、月經不調及湯火傷（即燒傷或燙傷）；治療湯火傷時，中醫學上可以直接以花入藥，可初窺其修復能力及安全性[2]。

滇山茶主要含有兩大類功能物質，揮髮油及多酚類。揮髮油以醇類為主，酯類、醛類、烯烴類和烷烴類為輔，主要成分為芳樟醇、芳樟醇環氧化物、水楊酸甲酯、3-環己烯基-1-乙醛等，此類成分在無需香精添加的情況下，即可提供令人愉悅的純天然芳香氣味。而該花所蘊含的豐富的多酚類物質，如：黃烷醇類、花色苷類、黃酮類、黃酮醇類、黃酮苷類和酚酸類化合物等，滇山茶花的生物活性可能跟此類物質有關。

本文通過一系列體外實驗測試了透明質酸酶抑制率以評估該物質的保溼活性[3]；檢測還原力[4, 5]及超氧陰離子、DPPH自由基清除效果[6]以確定該物質的抗氧化能力；檢測酪氨酸酶活性[7]及細胞內黑色素生成的抑制率評價該原料潛在的美白活性。

1 實驗部分

1.1試劑

透明質酸酶（H3506）購於sigma；DPPH購於上海源葉生物科技有限公司；酪氨酸酶（BDP1041）購於博美生物科技有限公司；

1.2部分溶液的配製

乙醯丙酮溶液：配置10 mL碳酸鈉溶液（0.1 M），加入0.7 mL乙醯丙酮。

埃爾利希試劑：稱取0.8g對-二甲氨基苯甲醛溶於15 mL濃鹽酸和15 mL無水乙醇中。

1.3保溼活性測定—透明質酸酶活性測定

取0.05 mL CaCl2（0.25 mM）溶液和0.25 mL透明質酸酶液(1.25 KU/mL)混合均勻，於37℃溫育20 min；分別加入滇山茶花提取液樣品0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.25 mL，並用醋酸緩衝液（pH 5.6）補足到0.25 mL，繼續於37℃溫育20 min；加入0.25 mL透明質酸鈉溶液於37℃溫育30 min；常溫放置5 min後，加入0.05 mL NaOH（0.4 M）溶液和0.25 mL乙醯丙酮溶液，置於沸水浴中加熱15 min後立即用冰水冷卻5 min；加入埃爾利希試劑0.5 mL並用1.5 mL無水乙醇進行稀釋，放置20 min顯色，於535 nm下測定其吸光值。每個濃度設置三個平行樣，透明質酸酶抑制率（IRHA）由下式計算：

其中Asample代表樣品平均吸光度值，Asampleo代表醋酸緩衝液替代酶液時的平均吸光度值，Acontrol代表醋酸緩衝液替代樣品時的平均吸光度值，Acontrolo代表醋酸緩衝液替代酶和樣品時的平均吸光度值。

1.4 抗氧化活性測定

1.4.1 還原力測定

分別取滇山茶花提取物待測樣品0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL，並用PBS緩衝液（0.2M，pH 6.6）補足到1.0 mL；取VC溶液（260 μg/mL）0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL作為陽性對照，並用PBS緩衝液（0.2 M，pH 6.6）補足到1.0 mL。在各組樣品中加入1 mL PBS緩衝液（0.2 M，pH 6.6）和1 mL鐵氰化鉀溶液（1%），混勻後，於50℃水浴20 min，取出，加入1 mL三氯乙酸溶液（10%），混勻；用移液槍移取2 mL混合液於5 mL試管中，加入2 mL蒸餾水和0.4 mL三氯化鐵溶液（0.1%），迅速混勻，於700 nm下測定其吸光值。每個濃度設置三個平行樣，還原力（RP）由下式計算：

其中Asample代表樣品平均吸光度值，Ao代表VC溶液（260 μg/mL）添加量為1.0 mL時的平均吸光度值。

1.4.2 超氧陰離子清除能力測定

取5.6 mL Tris-HCl緩衝液（50 mM，pH 8.2），分別加入0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL滇山茶花待測樣品，並用Tris-HCl緩衝液（50 mM，pH 8.2）補足至0.4 mL，於25℃溫浴10 min；而後加入25℃預熱過的鄰苯三酚（60 mM）100 μL，充分混勻；加入鄰苯三酚開始準確計時3 min後，加入50μL VC溶液（5%）終止反應（註：室溫高於25℃可以在室溫下操作）；10 min後於420 nm下測定其吸光值。每個濃度設置三個平行樣，超氧陰離子清除能力（SOP）由下式計算：

其中Asample代表樣品平均吸光度值，Acontrol代表用Tris-HCl緩衝液替代樣品時的平均吸光度值，Anull代表用HCl溶液（12 mM）替代鄰苯三酚時的平均吸光度值。

1.4.3 DPPH自由基清除能力測定

分別取0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL滇山茶花待測樣品於試管中，用蒸餾水補足到1.0 mL，加入4 mL DPPH甲醇溶液（39.4 μg/mL），混勻，於暗處放置30 min，不斷震蕩，於517 nm下測定其吸光值。每個濃度設置三個平行樣，DPPH自由基清除能力（FR）由下式計算：

其中Asample代表樣品平均吸光度值，Acontrol代表用蒸餾水替代樣品時的平均吸光度值，Anull代表用甲醇溶液替代DPPH甲醇溶液時的平均吸光度值。

1.5美白活性測定

1.5.1酪氨酸酶活性測定

分別取滇山茶花提取物待測樣品0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL及1.0 mL，並用PBS緩衝液（0.1 M，pH 6.8）補足到1.0 mL；取熊果苷溶液（0.1%）0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL及1.0 mL，並用PBS緩衝液（0.1 M，pH 6.8）補足到1.0 mL，作為陽性對照；加入3 mL L-酪氨酸溶液（90 μg/mL）於37℃溫育15 min後，加入酪氨酸酶溶液（1070 U/mL）0.1 mL，於37℃下反應25 min，於470 nm下測定其吸光值。每個濃度設置三個平行樣，酪氨酸酶抑制率（IRTyr）由下式計算：

其中Asample代表樣品平均吸光度值，Acontrol代表用PBS緩衝液替代樣品時的平均吸光度值，Anull代表用PBS緩衝液替代酪氨酸酶液時的平均吸光度值（註：檢測陽性對照熊果苷時，Anull值為0）。

1.5.2細胞內黑色素生成模型

1.5.2.1細胞培養

選擇對數生長期的B16細胞，經1.25%胰蛋白酶消化，用含有10%胎牛血清的DMEM培養基傳代，置於培養箱於37℃，5% CO2環境中進行培養。

1.5.2.2 細胞內酪氨酸酶活性測定

取對數生長期的B16細胞，接種於6孔細胞培養板培養過夜。分別加入終濃度為1%的滇山茶花提取物和0.8%的1,3-丁二醇，以未處理組作為細胞對照（Control），每組兩個復孔。培養48 h後用PBS緩衝液洗滌一次，每孔加入100 μL裂解液，刮取收集細胞，離心取上清。

取50 μL細胞上清液至96孔板，再加入50 μL左旋多巴（1%），37℃溫育1 h，於470 nm下測定其吸光值。酪氨酸酶活性相對變化量（TM）由下式計算：

其中Asample代表樣品平均吸光度值，Anull代表用PBS緩衝液替代左旋多巴時的平均吸光度值，Acontrol代表細胞對照組的平均吸光度值。

1.5.2.3黑色素測定

取對數生長期B16細胞，接種於T25細胞培養基，培養過夜。分別加入終濃度為1%的滇山茶花提取物和0.8%的1,3-丁二醇，以未處理組作為細胞對照（Control），每組兩個復孔。培養48 h後，用0.25%胰酶消化收集細胞，離心後用PBS洗滌一次，加入NaOH吹打數次，放入80℃水浴，取上清液，於470 nm下測定其吸光值。黑色素相對含量（MC）由下式計算：

其中Asample代表樣品平均吸光度值，Acontrol代表細胞對照組的平均吸光度值。

1.6 安全性測試

採用MTT法，收集對數生長期B16細胞，接種於96孔培養板培養過夜。分別加入終濃度為0.63%、1.25%、2.50%、5.00%、10.00%、20.00%的滇山茶花提取物和溶劑，未處理組作為細胞對照組（Control），每組設3個復孔，培養結束前4 h，加入MTT培養，共培養48 h後終止培養。加入二甲亞楓溶解結晶，於490 nm下測定其吸光值。B16細胞活率（RA）由下式計算：

其中Asample代表樣品平均吸光度值，Acontrol代表細胞對照組的平均吸光度值。

2 結果與討論

2.1 保溼活性

透明質酸為大分子多糖類物質，其網狀交聯結構賦予了其天然的保溼性能，是公認的保溼劑。同時人體內普遍存在的透明質酸酶卻可將其水解，使其喪失保溼活性。因此通過抑制透明質酸酶的活性，可以降低透明質酸的水解，通常作為篩選保溼劑的靶點之一。我們通過測定不同添加量的滇山茶花提取物對透明質酸酶的抑制效果，來反映樣品的潛在的保溼性能，結果如圖1所示。隨著添加量的增加，滇山茶花提取物對透明質酸酶的抑制效果逐漸遞增，添加量過高時，有較小幅度的下降趨勢；當添加量為3.2%時，抑制效果最佳，透明質酸酶抑制率大於60%。結果顯示，滇山茶花提取物在較低添加量時，即可取得令人滿意的透明質酸酶抑制效果，表明該物質確實具有潛在的保溼性能，同時具備較高的效價比。

2.2 抗氧化活性

內源性和外源性衰老都與自由基對皮膚細胞遺傳物質的損害有關，活性分子良好的自由基清除活性是潛在抗衰老能力的標誌。本文我們通過測定不同添加量下，滇山茶花提取物的還原力、超氧陰離子清除能力和DPPH自由基清除能力，以反映滇山茶花提取物抗氧化能力的大小。

測定還原力時，我們選擇了抗壞血酸（VC，260 μg/mL）作為陽性對照，結果如圖2所示。結果顯示，在實驗添加量下，滇山茶花提取物均表現出極佳的還原效果（均大於90%），與高添加量12%的抗壞血酸還原力水平相當，說明滇山茶花提取物比抗壞血酸具有更穩定的還原力，這是潛在抗氧化特性的標識。

滇山茶花提取物對超氧陰離子的清除能力如圖3所示。可以觀察到，當添加量小於3.2%時，超氧陰離子清除效果隨樣品添加量增加而激增，當樣品添加量為3.2%時，超氧陰離子清除率已接近40%；之後添加量進一步提高，清除效果略有降低。滇山茶花對DPPH自由基的清除能力如圖4所示，在測試濃度下，滇山茶花均表現出極強的DPPH自由基清除能力，均大於94%，最低添加量（2.0%）與最高添加量（20.0%）對DPPH自由基的清除能力相當，約為96%，因此，我們認為在最低添加量時，滇山茶花提取物已經表現出優秀且穩定的DPPH自由基清除能力。

綜上所述，基於本實驗室製備的滇山茶花提取物在較低添加量時，即表現出較強的還原力、超氧陰離子清除能力及DPPH自由基清除能力，顯示突出的抗氧化能力。因此，我們認為滇山茶花提取物可用於對抗自由基造成的衰老，且具備很好的費效比。

2.3 美白活性

黑素主要由位於表皮細胞基底層的黑素細胞產生，其含量及分布決定了人體的膚色差異。黑素的產生包括一系列複雜的生理過程，該過程始於酪氨酸在酪氨酸酶的作用下被氧化為多巴醌，為黑素產生的限速步驟，因此催化該反應發生的酪氨酸酶通常被認為是抑制黑素產生的關鍵靶點。本文通過體外酶模型和細胞內黑色素生成模型檢測滇山茶花提取物對酪氨酸酶的抑制作用及黑色素生成的影響。

體外抑制酪氨酸酶活性如圖5所示，隨著樣品添加量的增加，酪氨酸酶抑制效果穩步增加，樣品添加量為4.0%時，酪氨酸酶活性被抑制一半。細胞內酪氨酸酶活性測定結果如圖6所示，以未處理細胞（Control）及溶劑1,3-丁二醇（0.8%）作為對照，1,3-丁二醇的相對酶活為93%，可認為溶劑對酪氨酸酶有一定程度抑制；而滇山茶花提取物（1%）的相對酶活為87%，可確定該物質對細胞內酪氨酸酶活性確實有抑制效果。細胞內黑色素含量相對變化如圖7所示，以未處理細胞（Control）及溶劑1,3-丁二醇（0.8%）作為對照，1,3-丁二醇對黑色素的生成量有較弱的促進作用；而滇山茶花提取物（1%）則可較大程度抑制黑色素的生成，將黑色素相對含量降低至約70%。

綜上所述，體外酶和細胞實驗證實滇山茶花提取物對酪氨酸酶活性和黑色素生成均有明顯的抑制作用，且在1%添加量時，即可較大程度抑制細胞內黑色素的生成。

2.4 安全性測試（MTT實驗）

活細胞維持正常的生命活動需要能量，線粒體則是能量轉換的重要場所，線粒體內膜上的琥珀酸脫氫酶是能量轉換過程的重要酶類，因此通過測定琥珀酸脫氫酶的活性可間接反映細胞活性。琥珀酸脫氫酶可使底物脫氫，將四甲基偶氮唑鹽（MTT）還原成藍紫色顆粒，溶解於有機溶劑中，通過吸光值檢測顏色深淺可表徵琥珀酸脫氫酶活性，以間接反映細胞活力[8]。

我們通過檢測滇山茶花提取物在不同添加量下對細胞存活率的影響（如圖8），並以溶劑1,3-丁二醇（0.8%）作為對照，可知，添加量小於1.25%時，細胞存活率均大於80%，且細胞毒性主要來源於溶劑作用；觀察同一添加量時，滇山茶提取物與溶劑的細胞存活率，可認為滇山茶提取物對細胞存活有一定程度的有益影響；隨著樣品添加量的進一步提高，細胞存活率進一步下降。綜上，我們認為，滇山茶提取物添加量小於2.5%時，測試樣品幾乎不影響細胞存活率。

3 結論與展望

我們通過現有的成熟實驗模型證實特定部位的滇山茶花提取物在保溼、美白、抗氧化等三方面均表現出優異的應用潛力。基於我們豐富的植物活性物開發經驗，這在本實驗室已開發的植物活性物中並不多見。我們在實驗中還發現滇山茶花提取物在低濃度和高濃度時均有助於提高細胞存活率，這預示我們未來可在其對抗細胞衰老（Cellular senescence）和複製性衰老（Replicative senescence）方面做進一步研究。同時考慮滇山茶花提取物鮮明的天然來源和民族文化背景，其在多效合一型抗衰老產品中有較好的市場前景。