面對面專家
關明：隨著分子遺傳知識的積累，DNA和RNA分子的定量變得越來越重要。人們發明了諸多方法，以便儘可能精確地量化核酸的數量。在序列特異性定量方法中，基於聚合酶鏈反應(PCR)的技術一直是較為理想的選擇。實時定量PCR被認為是生物醫學實驗室的常規操作，但由於其計量的靈敏度有限，無法滿足越來越嚴格的定量要求，尤其是當目標濃度較低或存在PCR抑制劑幹擾精細測定時。此外，隨著下一代測序和單細胞分析等技術的不斷發展，人們對核酸定量的興趣已經達到了前所未有的單分子水平，這導致了數字PCR技術的繁榮。「限制稀釋PCR」和「單分子PCR」是最初用來描述這種方法的名稱，直到更流行、更貼切的術語「數字PCR」被提出，很快引起了生物醫學研究者的廣泛關注。數字PCR 的策略很簡單，就是「分而治之」，這是一個很好的比喻。DNA樣品分別在獨立但相同的分區中進行擴增，每個反應的全或無檢測結果均遵循泊松分布。在計算陽性反應的總和後，通過泊松校正，不僅可以得到目標分子的濃度，還可以得到目標分子的絕對數量。因其高靈敏度和特異性，數字PCR目前正應用於絕對等位基因定量分析、病毒核酸檢測、罕見突變檢測、拷貝數變異分析、DNA甲基化分析、基因重排分析。組織和血液是數字PCR 技術主要應用的標本類型，使用腦脊液、尿液、房水等其他體液的新方法也正在開發中。
本期主持人邀請了國內從事數字PCR 研究的多位專家，一起來探討數字PCR 目前在臨床應用上的優勢與挑戰，同時也展望了今後在該技術領域的發展方向。
1、與其他傳統擴增技術相比，數字PCR在臨床常規使用中有何優勢?
郭瑋：與傳統螢光定量PCR技術相比，數字PCR的靈敏度高，更適合常規臨床使用。數字PCR的原理是將標準PCR反應體系分配至大量微小的反應單元中，這能大大提高PCR反應體系對抑制物的耐受能力。傳統的擴增技術的靈敏度只有1%，但數字PCR可輕鬆實現單分子檢測，靈敏度可達0.1%甚至0.001%，這對於臨床上痕量核酸標本檢測、複雜背景下稀有突變檢測，尤其是循環腫瘤DNA檢測特別適用。隨著檢測技術的發展，現有的數字PCR檢測平臺的工作操作流程相對簡單，兼容性強，且二維的結果圖能更直觀地讀取數據[1]。
劉維薇：此外，數字PCR還可以實現絕對定量，突變擴增阻滯系統(ARMS)技術只能得到定性結果，傳統的絕對或相對定量PCR的分析結果高度依賴於標準曲線或者內參基因，無法做到精準絕對定量。數字PCR在結果判讀時僅判斷「有/無」兩種擴增狀態，通過直接計數或泊松分布來進行定量分析，實現了真正意義上的絕對定量。
婁加陶：在PCR過程中影響擴增效率的因素眾多，比如酶、引物水平、PCR抑制物等，不能保證其定量分析所依賴的基礎——循環閾值(Ct)的恆定性，使得相同實驗不同次重複檢測結果的重現性較差，甚至可能會得到完全相反的結果。與螢光定量PCR不同的是，數字PCR通過終點螢光信號計算濃度，不依賴於Ct值，因此不受擴增效率影響，能夠將誤差控制在5%以內，實現檢測結果的高度重複性。
田月如：數字PCR在減少使用通用引物或探針設計在多樣性靶序列導致錯配方面也具有優勢[2]。數字PCR平臺可以與新一代基因測序技術(NGS)對接，實現對測序文庫的質量控制，提供對測序文庫的定量分析和質量評估信息。一方面，數字PCR對NGS 的測序結果進行驗證，確保測序結果可信度;另一方面，所得到的結果還包含反映測序文庫質量的信息，如接頭與接頭二聚體、錯誤連接片段、過長連接片段等，這是當前其他方法所不具備的優勢[3]。
郭永：基於以上提到的優勢，數字PCR尤其適用於臨床低豐度核酸分子的檢測和定量。舉3個例子：(1)腫瘤的液體活檢，通過檢測血漿中的腫瘤循環DNA(ctDNA)，為腫瘤的伴隨診斷、療效監控和預後判斷提供可靠數據[4]；(2)標本中少量病原體檢測，比如腦脊液感染、術後菌血症、HBV和HIV用藥後的檢測[5]；(3)器官移植排斥的監控，可以更早發現急性排斥，緊急幹預[6]。
2、在所有現有的商業產品化的數字PCR平臺，數字PCR都得到了越來越多的研究，特別是對癌症應用領域，數字PCR的出現對癌症研究有哪些貢獻?
郭瑋：數字PCR具有高靈敏地檢測痕量靶核酸的能力，有助於從分子表型層面早期發現腫瘤的耐藥突變，提示臨床耐藥的潛在可能性，優化藥物治療方案。加之其能發現複雜背景下的稀有突變，適用於檢測各種體液標本(如血液、胸腔積液、腦脊液、尿液)中的腫瘤相關突變，有助於了解患者體內腫瘤突變的全貌，一定程度上克服腫瘤的異質性[7]。相比於NGS，數字PCR對實驗室人員和設施的要求低，操作流程簡易，報告時間快速，便於臨床實驗室工作的開展。
劉維薇：腫瘤個體化診療已經成為業內的共識，基因檢測也已在臨床實踐中得到普及。數字PCR技術通過對標本的微滴化處理，能在每個微滴中有效地降低正常體細胞DNA背景的幹擾，不僅能實現對腫瘤標記物的有效檢測，還能定量監測突變頻率變化，量化檢測標準。目前已有大量文獻和實例報導了數字PCR技術成功應用於EGFR、KARS、BRAF、PIK3CA、DNMT3A等各種癌基因突變檢測，以及癌症相關的如HER2基因擴增檢測[8-10]。
婁加陶：數字PCR的出現有效彌補了第2代PCR系統靈敏度低、重複性差、無法進行精確定量等缺點，在癌症研究領域潛力巨大。比如：在癌症早篩領域，目前基於數字PCR對易感或高危人群的血液、尿液、唾液等體液標本中核酸水平的腫瘤標誌物(如ctDNA、miRNA等)可以實現單分子水平的痕量檢測，以及表觀遺傳學的DNA甲基化定量檢測，其發現疾病的時間遠早於影像學或其他蛋白類標誌物，大大提前了疾病發現的窗口期，可以更好地實現早診斷早治療。另外，利用數字PCR技術還可以富集標本中的待測靶基因，用於二代測序輔助建庫、文庫質控和測序結果驗證等，極大地推動了腫瘤精準治療的進步。
田月如：數字PCR由於標本用量少，高敏感性、高特異性的特點，克服了腫瘤組織包埋標本DNA質量差、標本量有限等主要問題，為臨床檢測多種癌症基因突變提供更客觀、自動化程度更高的定量檢測結果[11]。目前，數字PCR已成為檢測多種癌症基因突變最準確、最可靠的工具之一，應用於腫瘤標本的等位基因絕對定量、罕見突變檢測、拷貝數變異分析、DNA甲基化和基因重排等，以及各種惡性腫瘤的診斷、預測和監測[7]。
郭永：數字PCR目前對癌症研究和治療方面的貢獻主要在液體活檢領域。WAN等[12]研究表明：血液檢測與組織檢測相比，對指導EGFRTKI治療的價值結果相當，數字PCR可以更好地檢出血液EGFR突變。王潔教授和吳一龍教授牽頭的BENEFIT研究結果顯示：採用數字PCR檢測血液EGFR突變狀態對指導一線吉非替尼靶向治療具有良好的療效和安全性[13]。這些研究為數字PCR在液體活檢的臨床應用提供了循證醫學證據，為將來腫瘤分子診斷模式改變打下了基礎。數字PCR有望成為癌症療效監控的主要技術手段。
3、作為一種標準，數字PCR 在病原微生物的定量檢測上具有不可比擬的優勢，具體表現在哪些方面?
郭瑋：病毒等微生物的載量對於闡釋疾病病程，後續治療及療效評估是至關重要的，即便是載量的輕微波動，因此需要數字PCR高精確和穩定的分析。同時在缺乏標準品的檢測項目中，數字PCR可用於直接定量病原微生物的拷貝數。
劉維薇：在病原微生物的檢測(病毒、細菌、支原體等)方面，數字PCR利用其靈敏度高的特點，對各種樣品中的病原微生物展開廣泛的研究。如人類免疫缺陷病毒(HIV)抗逆轉錄病毒治療過程中病毒殘留的監控；C型肝炎病毒(HCV)的分子分型；抗甲氧西林金黃色葡萄球菌的院內感染監控;環境微生物不同功能基因之間的連鎖分析等[14]。
婁加陶：在病原體鑑定方面，數字PCR的高靈敏度決定了臨床標本無需經過病原微生物培養過程即可進行檢測，大大縮短了報告周期，使快速檢測潛在的病原微生物成為可能，且利於從大量不同的背景核酸中檢出病原微生物，對於感染性疾病的診斷和控制意義重大。另外，在耐藥基因檢測方面，相對於敏感性差、解析度低的實時螢光PCR技術，數字PCR能早期(痕量)檢測罕見藥物抗性相關序列變異，如：B型肝炎病毒(HBV)、結核分枝桿菌的耐藥突變檢測、及時、準確地動態監測各種耐藥表型和基因型，給臨床研究和患者管理帶來潛在影響，有助於及時減少患者服用無效藥物的數量，及早採用其他備用藥物[15]。
田月如：數字PCR技術尤其在病原體待測標本較難獲取且稀有的情況下尤為有用。復旦大學附屬華山醫院一項將數字PCR用於青光眼睫狀體炎症候群(PSS)患者的房水中病原體檢測的研究發現，人巨細胞病毒(HCMV)可能是我國PSS的最主要致病因素，高達45%的PSS患者的房水標本中檢出了HCMV，比例顯著高於國內的相關報導[16]，未發現PSS患者房水中存在單純皰疹病毒(HSV)、巨細胞病毒(EBV)和水痘帶狀皰疹病毒(VZV)。該研究發現微滴式數字PCR法比螢光定量PCR的檢測結果更加靈敏、準確，更適合用於房水標本中微量病毒的檢測，此外，微滴式數字PCR法的高靈敏度可以避免對患者進行重複穿刺取樣，減少患者在被穿刺取樣過程中的恐懼和痛苦。這也是全球首家關於在房水這樣的特殊體液中應用數字PCR 的報導。
郭永：在細菌/病毒的核酸載量測定方面，螢光定量PCR技術的最大瓶頸在於需要依賴標準曲線，而且擴增效率的差異會直接導致實驗室內或者不同實驗室之間的螢光定量PCR檢測結果的偏差。數字PCR基於單分子層面的計數可以擺脫對標準品的依賴，且不受PCR抑制物的影響，從而實現對病原微生物核酸的精準絕對定量，表現出較高的可重複性。利用數字PCR進行核酸的病毒載量測定，依賴其靈敏度高的特點，可以用於早期診斷和用藥的低拷貝病毒的監控。
4、毫無疑問，作為一種新型核酸檢測技術，數字PCR 即將進入臨床使用，在進入臨床前還有哪些質量管理問題需要解決?
郭瑋：性能確認方面，數字PCR屬於實驗室自建檢測方法，正式進入臨床使用前，臨床實驗室應進行全面的性能確認[17]。臨床指南和建議的缺失使得各實驗室間對性能確認的要素和判斷標準存在差異，導致臨床使用結果的差異，因此不同分液原理的數字PCR平臺間需要進行檢測結果比對。各種數字PCR方法與傳統檢測方法之間的檢測結果的一致性也需要大量的比對和驗證實驗。只有如此，才能保證數字PCR技術可以成熟地進入臨床檢測。
劉維薇：數字PCR臨床檢測尚無國家或行業統一標準，且缺乏商品化的室內質控品，因此需要建立適宜的室內質控措施，建立規範化的標準檢測分析流程。數字PCR的靈敏度較高，操作過程極易受到外源汙染，因此做好實驗室內部質量控制，建立規範標準的檢測操作流程和結果評估分析體，是保證檢測結果準確性和可靠性的前提。
婁加陶：數字PCR操作對技術要求相對較高，需要加強人員培訓。因為數字PCR的靈敏度很大程度上取決於生成的反應單元的數目，而反應單元的生成數目比如微滴式數字PCR的微滴生成數則高度依賴於技術人員的操作熟練程度，目前數字PCR尚不能很好地實現自動化，因此對技術人員的操作培訓尤為重要;結果報告方面，如何合理地審核和報告低豐度的檢測結果，也是臨床實驗室在臨床實踐前需要考慮的要點。
田月如：數字PCR每個反應有限的標本體積限制了分析的檢測下限，由於有限數量的分區限制了小動態範圍。分區中並非所有模板均被擴增，任何時候均可能出現分子斷流導致假性低量化，這在定量RNA時尤其突出，某些RNA靶點逆轉錄可能不完整，標本中並非所有拷貝均被檢測到。此外，對於較大的擴增子數字PCR尚不能準確量化。標本吞吐量較低，汙染風險高均是數字PCR面臨的主要問題。目前，大多數數字PCR儀器只能測量兩種螢光，限制了同一樣品中不同目標的多重檢測能力。如果數字PCR的具體應用需要納入內部控制，則可能需要基於不同染料濃度或染料混合物的更複雜的多重策略。數字PCR平臺反應液的選擇仍受商業儀器的限制，不同廠家試劑和平臺的結果尚存在差異[18]。
郭永：數字PCR技術極其靈敏，需要進行技術設計防汙染管理，通過晶片和其他耗材的設計，儘量避免微液滴和外界環境接觸的機會，做到不開蓋擴增檢測，減少假陽性。
5、目前已經商業化的數字PCR 是或者基於「油包水」分散液滴，或者基於晶片分散，基於「泊松」分布的理論，隨著微流控方法被用於數字PCR平臺的開發，可以設想未來還有哪些在技術上能促進數字PCR的新技術和新算法?
郭瑋：微流控技術的發展使得數字PCR的操作相對便捷，且液滴生成的固相體系相對穩定。隨著新技術和算法的發展，數字PCR將獲得卓越的置信水平和真實可信的數據結果，同時推動其在不同檢測和應用需求方面的應用，如單細胞核酸檢測、T790M/C797S的順式或反式的鑑定。數字PCR是一種新興的檢測方法。作為一種全新的思路和手段，臨床對其應保持一種包容的心態。此檢測平臺將有助於臨床深入到分子生物學研究的更高層次。
劉維薇：數字PCR更擅長對已知極微量核酸標本、複雜背景下稀有突變和表達量微小差異的標本進行檢測，而測序技術主要針對未知核酸或複雜標本進行分析。如果未來可以有對液滴的檢測更加直觀的檢測技術，無疑能更好地推動數字PCR在臨床的實際應用[19]。
婁加陶：首先，比較容易想到的是開發多靶點檢測的多重數字PCR檢測，可以通過兩種方式實現，(1)使用多種螢光染料來標記不同的待測靶基因，利用多個螢光檢測通道來實現;(2)採用單波長多強度技術，使用一種螢光染料，但是擴增結束時不同靶基因對應染料的螢光強度不同[20]。其次，目前的數字PCR大多採用螢光檢測手段，雖然較為便捷和靈敏，但需要依賴昂貴的光學儀器和攝像設備，而且PCR結束後離線檢測耗時耗力且容易引入汙染，設想未來可以發展一種能夠在線監測、且低成本、高速度、高通量的檢測方法，比較有前景的是電化學生物傳感器。另外3D列印微流控晶片技術相對於傳統的微流控加工技術具有設計加工快速、材料適應性廣、集成化程度高、精度更高、成本更低的特點，對於微流控晶片數字PCR技術的推廣應用具有積極的意義[21]。
田月如：與已有分散方法相比，基於列印的樣品分散法具有更好的效果，該平臺具有自動化和反覆使用的特點。液體彈珠樣品分散法可以滿足手持數字PCR設備的所有要求，各種移動技術均可用於液體彈珠。該方法將惰性疏水物質包裹在內部含PCR混合物的液滴上，使得進行熱循環相對簡單。此外，惰性疏水粉末不與PCR混合物反應，避免汙染。焦耳加熱法因其加熱時間控制簡易，與活性TEC結合，使加熱、冷卻的最佳斜坡速率優化了擴增效率，不失為一種理想的數字PCR熱循環方法。基於LED的照明系統幾乎可以滿足未來數字PCR系統的所有要求。低成本數位相機作為探測器。數據處理模塊及整個設備可以由低廉的微型計算機控制。使用自主開發的圖像處理和輸出量化的軟體大大降低系統成本。基於智慧型手機的螢光檢測儀也在一定程度上降低硬體複雜性和成本。這些新技術都將在未來促進數字PCR的發展[22]。
郭永：數字PCR的發展方向包括：(1)提高檢測通量，可對多個靶標多個標本並行檢測；(2)提高檢測自動化程度，實現一鍵式檢測的自動化檢測流程；(3)提高檢測速度，進一步降低檢測時間；(4)提高檢測動態範圍；(5)降低檢測成本。這些提高，將會使數字PCR用於更多分子檢測。目前，非常需要國產高端科學儀器和醫療器械能夠站起來。人們高興地看到有識專家，與國產技術合作、評估和指導，一起推動技術的進步，體現了新時代專家的氣度和遠見。