平菇三級菌種(栽培種)製備：栽培種培養基的原料和配方將原種轉接到同一培養基上進行擴大培養，即為栽培種。所以栽培種培養基的原料和配方與原種培養基的相仿。
上述提供的平菇原種培養基配方，不做任何改變均可作為平菇栽培種配方。栽培種培養基製作栽培種培養基製作方法與原種製作方法相同栽培種多採用塑料薄膜袋來進行培養，塑膠袋裝量多，價格便宜，易於運輸，使用也方便。栽培種用高壓鍋滅菌時，必須用005毫米厚的聚丙烯塑膠袋；聚丙烯袋耐高溫高壓，高壓滅菌時不會變形。用普通蒸鍋常壓滅菌時，可選用035~004毫米厚的高密度聚乙烯塑膠袋。袋的規格有兩種，一種是寬17釐米長35釐米的折角袋，裝料與扎口方法和原種袋相同。
另一種是用寬17釐米的筒料，裁成3335釐米的段，一端在使用前用塑料繩扎口，裝料後再用塑料繩把另一埠紮好，扎繩緊貼料面，繩結外側留有2釐米的長度，為以後接放的菌種留有餘地。栽培種接種栽培種接種就是把原種接入栽培種培養料的過程。栽培種接種過程也要按照無菌操作的要求，可在接種室、接種帳進行，但要減少進、出次數和增加接量。
原種接入栽培種培養料時，用長柄鑷子或接種鏟挖取大棗大小1塊原種，放入塑膠袋培養料中央的洞口；也可用鑷子先將瓶內原種弄碎，然後瓶口對著袋口倒入弄碎的原種，使菌種撒在料面上，塞上棉塞，將塑膠袋口包紮好。一般1瓶原種可接種30袋一端封口的袋裝栽培種、60瓶瓶當加大接種量，這樣菌絲延快，培養時間可相應縮多可裝我種，12一5兩端開的袋裝栽培種如原種充足栽培種菌齡是自接種之日開始計算的，不同種類的食用菌栽培種生長速度不同，因此最適菌齡也就不同。
但是，無論菌絲長得快慢。均是菌絲長滿瓶(袋)後的7天內是使用的最佳菌齡。此期正是菌種的青壯年時期，菌絲分布均勻，細胞內營養物質積累充足，生命力旺盛，轉接後吃料快。菌種長滿後，隨著培養時間的延長，菌種逐漸老化，培養基失水，菌種幹縮，活力下降。因此，栽培種菌絲長滿瓶(袋)後要及時使用。栽培種是用於接種栽培出菇袋的，用種量多對菌袋培養基的覆蓋面大、發菌快，可以控制雜菌汙染和有效地縮短發菌時間，提早出菇。但是菌種不能作為培養基使用，所以對產量的提高沒有關係，也就是說不存在栽培種用量越大產量就越高的說法。
用種量過大還會出現菌袋的汙染問題，如接種時菌種的菌絲被打斷，堆積在出菇袋內，菌種受傷後呼吸強烈，產生很大的熱量分泌出很多的水分，若不能及時散發出去，就容易引起燒菌和死亡現象；死亡的菌絲被雜菌侵染後又感染新菌袋，則造成菌袋報廢。另外，菌種的菌絲菌齡比新接種的菌絲長30多天，容易在菌袋內出菇，影響菌袋的正常發菌。因此，接種時用種量應以覆蓋培養面為宜，不應過量用種。栽培種菌絲培養栽培種菌絲培養請參見原種菌絲培養。
菌種保藏和貯藏：1.菌種保藏菌種保藏的目的在於在較長時間內保持菌種的生存，保持菌種形態、遺傳、生理等優良的農藝性狀的穩定，保持其純培養狀態，免受其他生物的侵染菌種的保藏方法有很多，常用的有繼代培養低溫保藏、液體石蠟覆蓋保藏、蒸餾水覆蓋低溫保藏、超低溫冰箱保藏和液氮超低溫凍結保藏。
繼代培養低溫保藏將菌种放在4℃~6℃恆溫箱中保藏3~6個月，然後重新進行移接，移接後再放回恆溫箱內繼續保藏。此法是目前普遍採用的方法，優點是應用儀器設備簡單，操作方便、簡便易行。缺點是菌種退化快，較長時間保藏後常出現菌絲生長緩慢，甚至不能生長現象，有的品種還會形成色素。液體石蠟覆蓋保藏將無菌的液體石蠟覆蓋於菌種斜面表面，隔絕菌種的氧氣供應，以控制生長，減緩老化，減少變異。此法有時會出現大量分泌色素、發生角變、菌絲變稀弱、生長不正常等問題蒸餾水覆蓋低溫保藏將無菌蒸餾水注入需要保藏菌種的斜面菌種內，然後把菌袋(瓶)直立放置於4℃~6℃恆溫箱保藏，此法常被用作菌種的短期保藏，1年左右需要繼代培養1次。超低溫冰箱保藏此法需要超低溫冰箱，溫度控制在-76℃~-80℃,可以長期保藏。液氮超低溫凍結保藏此法是將菌種置於保護劑中，經程序降溫至-90℃,將菌種置於液氮容器中長期保藏。
2.菌種貯藏菌種貯藏的目的在於防止因汙染減緩菌種的代謝和造成衰老，保持菌種活力和純培養狀態，使之處於隨時可用的生理狀態，保持菌種的商品質量。菌種貯藏有以下基本要求。(1)環境衛生菌種貯藏場所要乾燥、潔淨，遠離石灰場、水泥場等粉塵大量發生地，以防粉塵導致的汙染。(2)環境溼度和通風貯藏場所不可溼度過大，要保持空氣流通良好，以帶走菌種呼吸而產生的大量水分，使空氣相對溼度保持在6%以下，以防汙染。(3)避光光照可加快菌絲老化，刺激子實體形成，子實體形成將消耗菌種的大量養分。
因此，菌種貯藏要避光，以避免子實體形成(4)適度分散貯藏期間菌種仍處於代謝狀態，其代謝的活躍程度主要取決於貯藏場所的溫度。當菌種緊密疊放時，代謝熱不能較快地散出，代謝產生的水分也不能及時排出，不利於菌種質量的保持。(5)減少人員出入過多的人來人往，易導致貯藏場所溫度升高，同時空氣流動使空氣中懸浮物增加，易造成汙染。因此菌種貯藏場所要儘量減少人員的出入，除定期定時的菌種貯藏狀態檢查外，應禁止一切無關人員的出入。
3.平菇菌種的貯存時間當培養基上長滿菌絲後，如果菌種暫時不用，可放置於較低的溫度下貯藏。母種在4℃~6℃條件下可貯藏時間90天，原種在4℃~6℃條件下可貯藏45天，栽培種在25℃以下條件下可貯藏10天、在1℃~6℃條件下可貯藏45天。