上世紀七十年代初,歐陽俊文、胡含等一批中國科學院遺傳研究所的科學家在小麥花葯離體培養方面取得重大突破,在國際上率先培育出第一株小麥花粉單倍體再生植株,於1973年在剛剛復刊的《中國科學》季刊第一期上發表了題為「小麥花粉植株的誘導及其後代的觀察」的科研論文。這是在那個年代由中國科學家自主完成的少有的原創性的重大科研成果之一,該文一經發表就引起了國內外學術界的廣泛關注和高度評價。
當時的Scientia Sinica 剛剛復刊,國門也初開,在國外還談不上有發行量。但該論文發表的消息在國外不脛而走,前來索取論文抽印本的明信片如雪片似的紛至沓來。包括植物組織培養的祖師爺之一,法國的R.J.Gautheret也寄來的索取函。《中國科學》編輯部早料到該文會受到特別關注,主動破例多加印了340份英文抽印本,這麼多的抽印本依然很快就被索取殆盡。
人們不禁會問,當時是如何取得這項成果,為什麼能在國際上引起細胞生物學界科學家的高度關注,其意義何在,現在的發展應用狀態等問題,試以回顧做一敘述。
連隊一次不尋常的生產計劃勤務會議
上世紀六十年代我國經歷了三年自然災害,加之惡化的國際環境和連續不斷地政治運動多重影響,造成全國性的糧食短缺、生活物品匱乏。黨和國家先後提出了「備戰備荒」、「抓革命、促生產」的號召。遺傳發育所的廣大科技人員克服困難排除幹擾,在良種培育、糧食生產上都做出了很大貢獻。例如雜交高粱的普及推廣,一定程度上緩解了有飯吃的問題。國慶二十周年,當展示遺傳所取得成果的彩車通過天安門檢閱時就讓全所的人興奮不已了。那時遺傳所引以為傲的3大成果是「高粱土豆打豬草(打豬草為一類糖化飼料)」。雖然這句話後來被系統外的一些單位的人調侃,說遺傳所名不副實,最多也就是高級農科所或良種站,但當年的這些成果的確激勵了遺傳所職工的工作幹勁。
1970年初,由於政治運動形勢趨於緩和,中國科學院已經允許做一些與生產實踐相聯繫的基礎性的科研工作。那是3月17日,遺傳所召開了全所科研生產會議,對落實 1970年科研生產計劃提出「五定」要求,即定方向、定任務、定指標、定措施、定人員,並強調科技推廣工作不能放鬆,商討基礎理論如何突破等問題。當時工、軍宣傳隊進駐遺傳研究所,將五個科研「專業隊」改為「連隊」編制,實行軍事化管理。所屬的第三連隊為落實1970年的科研生產計劃,在連勤務組的召集下於4月23日召開了連隊勤務會議,商議開展哪些項目的科研業務工作。莊家駿、顏秋生主持會議,從國內的形勢到遺傳所的現狀講起,全國各行業都取得很大成就,遺傳所的其他連隊也都出了許多好成果。提到我們連隊決不能落後拖後腿,除了現在常用的遠緣雜交和化學誘變育種方法外,希望大家集思廣益,提出適合連隊開展的育種新方法,加速育種進程,儘快取得好成績向黨和人民獻禮。那個年代人們就是這樣想,這樣說,這樣幹的。
會上李良才與歐陽俊聞講道可以嘗試開展一種「花葯培養」的新育種方法引起大家的極大興趣。年前李良才出訪日本時從一篇由日本科學家新關宏夫撰寫的綜述文章中看到了有關從曼陀羅、菸草、水稻等高等植物經花葯培養成功再生植株的報導而獲得啟發,找歐陽俊聞共同商議,覺得這一技術很有前途,能加速培養新良種,雖然缺少詳細技術資料,但認為國外能做到我們也一定能做成功。隨後李良才介紹了所了解的國際上花葯組織培養發展動態,談到這一工作的意義:在育種上可以縮短獲得純系的時間;在理論研究上,有助於在高等植物上進行猶如微生物上一樣的遺傳操作和分析。歐陽俊聞先生曾經有從事植物組織培養研究的經歷,為此著重介紹了組織培養的操作程序和所需要的基礎實驗條件。認為花粉培養也不是高不可攀,只要大家齊心協力,攻克花葯培養難關也不是沒有可能性。
科學發現是有時效性的,沒有把握住時機就會錯失機遇,所以那時決定開展花粉培養單倍體育種至關重要。但是花葯培養單倍體育種項目立項過程並不順利,且差點就胎死腹中。全連隊有幾十個人,會上主要發言講話的就幾個人,但爭論非常激烈。生產計劃工作會議持續開了一整天,上午未達成一致意見,下午接著議題繼續開會討論。這在以往少見的,通常連勤務會布置、討論工作計劃2小時內搞定。這次皆因部分人員質疑花粉培養的可行性,認為這是天方夜譚,沒有詳細技術資料參考佐證,遺傳所的組織培養的基礎薄弱,培養條件幾乎沒有。特別是連隊主要負責人之一的陳英先生就表示質疑,她極力主張連隊開展化學誘變或輻射育種研究,因為取得成果的把握機率更高些。莊家駿先生則表態聯繫實際工作本組問題不大,化學誘變已經在小麥方面開展了,提議爭取小麥夏播,立即開展小麥花粉培養的預備實驗。胡含發言表示同意,支持開展花粉培養研究,主張進行階段性的任務,化學誘變與組織培養工作可以結合起來,材料要分期播種,可以隨時進行實驗,保證能在『十一』獻禮。顏秋生也表示:「應集中精力搞小麥、水稻花粉組織培養工作,如果到年底花培工作無結果,再回頭抓水稻誘變工作亦不晚」。胡含先生在會上再次強調應該開展具有國際水平的研究項目,表示我們應該在水稻、小麥等主要農作物上開展花葯培養技術研究,爭取獲得突破,在國際上顯示祖國的科學事業的發展和進步。並且從花葯培養的原理上進行了一番分析,闡述了選題對科學研究的重要性。由於視野獨到,目標都是朝向國際水平的高度看齊,具有遠見卓識的眼光。一些與會者至今都對胡含的講話有深刻印象。經過大家認真討論協商,大多數同志都表態贊同開展花粉培養育種的新方案。在這種情形下,陳英也妥協了,表示「在花粉培養的同時,可以同時進行種子化學誘變處理」。意見統一了,顏秋生表示由他來負責撰寫科研生產計劃報告書,並向所革委會提交開展新育種方法的申請報告。即使這樣,陳英當晚還從中關村大老遠趕往北郊,試圖阻止顏秋生提交花粉培養育種方案,再次要求更改為化學誘變和輻射誘變育種方案。幸好被顏秋生直接回拒了,答覆說,「既然大家都在會議上通過了該方案,就讓先試試做上一年,誘變育種也可以做,相互之間並不產生矛盾。連隊人員多,可以讓一些人開展誘變育種試驗」。假使花培育種方案沒有實施,就沒有後來的一切,歐陽俊聞提起來還很感謝顏秋生能頂住壓力不妥協,使花粉培養育種技術在祖國開花結果。陳英雖然曾激烈反對開展花粉培養研究,但花粉培養工作正式展開後,她還是全身心投入了試驗工作,並在該領域取得很多成果,這是後話。
由於這一次連勤務會議契機,遺傳研究所開展了探索花葯培養與單倍體育種新方法的研究,從而在小麥花葯離體培養研究領域取得了舉世矚目的輝煌成就。
世界上第一個小麥花粉單倍體植株誕生
時間要追溯到六十年代,花葯培養首先在曼陀羅上取得了突破。1964年,印度科學家Guha S. and Maheshwari S.C.通過花葯培養獲得了毛葉曼陀羅(Datura innoxia)的單倍性胚狀體和小植株,並證明小植株來源於花粉 (1964. Nature, 204: 497)。但這篇重要文章並沒有引起中國科學家的關注,甚至沒有人讀過這篇論文。也許與當時我國政治形勢和所處的國際環境受到長期封鎖,幾乎沒有國際科技交流有關。連裡打出的旗號是要建立一個育種新方法,加速育種進程,這是符合當時中國科學院制定的科研大方向,計劃順利獲得到遺傳所革委會(當時所領導機構)的批准與支持。
1970年開始了花葯培養實驗,全連的二十多人團結一心齊上陣,參加了花粉培養的前期籌備工作。歐陽俊聞、李良才先生曾撰寫「花葯培養,曾經的輝煌」一文對當初的工作情景做了詳細描述:在連隊勤務組的領導下,人心齊、幹勁足,排除困難創造條件,前期工作很到位。從器材科庫房領出了已閒置多年的全部組織培養專用器材,包括玻璃器皿,試管架和試劑等;接收了所裡閒置的公用接種間和培養室。例如用紗布、棉花綑紮試管塞,大家齊動手,幾千個瓶塞在談笑聲中就做完了,真可謂「天時,地利,人和」。
花葯培養一開始就以小麥,水稻這兩個重要農作物為實驗材料,主要從那些為育種而配置的雜交組合F1代取材,因為當時科研工作必須和育種實際緊密結合,而恰巧也正是三連的優勢所在。當年5月就以大田小麥為材料開始做花粉培養,採用了大兵團作戰方式,接種量很大。但小麥花粉培養在當時國際上還是難題,初次嘗試雖沒成功,還是積累了一些經驗。
其中最辛苦的工作當數接種花葯,這不是人人都能做的,身體不好、眼神不佳、手指不靈活的都無法勝任。組織培養、花葯培養需要在無菌條件下操作,那時還沒有空調和空氣過濾設施,而接種間是在一個密閉空間,不能通風透氣,設立的隔離間、緩衝間也是密不通風。接種前用福馬林燻蒸消毒,再噴灑70%的衛生酒精,紫外線燈始終照射滅菌,僅在接種操作時臨時關閉。在那種條件下工作,光氣味就能使人窒息,而且進入接種間要換已滅菌的白大褂、戴口罩和帽子,加上操作臺上為消毒接種工具而燃燒的酒精燈,室內氧氣嚴重不足,工作一陣子就頭暈眼花,必須出來深呼吸、透透氣以緩解疲勞與壓抑。這種接種工作,只有經過親身體驗,才知到從小麥幼穗中挑揀出小小花葯實在不易,離遠了看不清,近了就可能導致汙染。
花培課題組科研人員鏡檢觀察分析花粉發育時期(1973年)
經過大家共同努力,當年(1970年)水稻花葯培養就獲得了再生植株,1971年又在國際上率先培育出了小麥花粉植株。相關研究結果於1972年1月在《遺傳學通訊》第一期上發表,題目為「從水稻、小麥花粉培養誘導植株研究初報」。這篇文章嚴格地說只能算是一份研究簡報,署名為遺傳所303組,正是三連的二十多位人員組成的科研團隊共同完成的水稻、小麥花粉誘導再生植株的報告。《遺傳學通訊》是內部刊物,1971年創刊,半年出版一期,主要以贈閱方式在國內發行,但依然引起了國內許多科研人員的關注。
在這篇報告中提到,最先開展小麥花粉培養起於1970年春。當時僅獲得了愈傷組織的細胞團塊,卻沒有分化出根或芽,但發現找到了關鍵因素,是癒合組織質量與培養基成分的關聯。因而在八、九月開展水稻花葯培養時對培養基成分做了一系列改進實驗,其中蔗糖濃度提高一倍後所形成的癒合組織比較容易分化出再生幼苗,當年就獲得200多株水稻綠苗。經過顯微鏡檢查根尖染色體,部分植株是單倍體,大部分為二倍體。1970年有47株水稻花粉植株移栽成活,半數自然結實。關於水稻花粉培養基、培養方法主要參考國外的資料,並做了適當改進,也在本期《遺傳學通訊》上以303組署名發表了題目為:「從花粉培養出植株的研究及其意義」的文章。報導了國外相關研究進展,對這項研究的意義和前景作了評估和預測,主要就是能大為縮短育種時間,提高選擇性和效率等,在理論研究上也有重大意義。通過離體花粉培養的單倍體和純合二倍體進行形狀分析,研究遺傳規律相結合,為育種方法提供理論指導。從本文也看出小麥花粉植株於1971年培育成功,因有了小麥、水稻失敗與成功的兩次實踐,根據經驗做了認真分析,著重於解決第一步培養中影響癒合組織質量的主導因素,調整了培養方案。接種了上萬個花葯,終於把小麥花粉幼苗培養出來了。3月份取溫室栽培的春性和半冬性小麥為材料進行小麥花粉培養,花葯取自花粉單核時期,採用MS培養基,蔗糖濃度提高到6%,補加2,4-D 2ppm,水解去氧核糖核酸10-120ppm,在低於25℃溫度條件下培養。花葯經過十餘天培養後就陸續長出癒合組織,將癒合組織轉移到補加有吲哚乙酸和激動素各0.2ppm的MS培養基後即分化出了芽和根。因從4月下旬開始,陸續有小麥綠芽分化出來,最後得到了多達49株小綠苗。由於小麥試管苗移栽不易,死亡率很高,僅有16株長大成熟。鏡檢證明多數是單倍體,也有少部分二倍體,移栽後有的已能自交結實,經後代分析也證明,這些二倍體也是單倍體自然加倍的純合二倍體。在1970-1971年積累經驗的基礎上,為1972年的小麥花葯離體培養工作設計了幾個實驗程序,有目的地對培養基、培養方法和條件做了改進,也進行了系統的細胞遺傳學觀察分析,取得了很大的進展,獲得的花粉植株就達幾百株了。
小麥花葯離體培養成功獲得再生植株消息傳出後,中央新聞電影製片廠聞訊來遺傳所跟蹤拍攝了301組科研人員進行小麥花葯誘導培養並獲得再生植株的全過程,剪輯編排成「花粉育珠」的短紀錄片。當年國慶節前在全國播映了「偉大祖國欣欣向榮」的6集系列紀錄片,其中第三集反映科技戰線成就中就特別加入了「花粉育株」短片,擴大了國內的知名度和影響力,全國各地紛紛來人學習取經,很快花葯培養技術就在全國推廣普及了。
正巧在1973年《中國科學》正式復刊了,在復刊後的第一期英文版上發表了以歐陽俊聞、胡含、莊家駿、曾君祉署名的「小麥花粉植株的誘導及其後代的觀察」論文。發表時間雖晚了點,但內容卻更系統,更有深度。這篇論文不僅僅報導獲得小麥單倍體植株,內容還包括多種培養基試驗,不同花粉發育時期的影響以及培養初期花粉發育的細胞學變化等。此外,還有愈傷組織質量的組織學描述。更值得注意的是還觀察到了來源於雜種F1花粉植株後代不分離的現象。因為工作非常系統,實驗數據詳實,同時介紹了詳細的培養條件,實驗方法、步驟和結論,起點水平很高,自然引起了國內外學術界的高度關注。
花葯培養工作剛開始都是二十多人一同做,水稻、小麥培養也沒分組,只是每人側重某方面工作。1972年遺傳所科技人員也分批分期到中國科學院在河南和湖北建的「五七」幹校進行勞動鍛鍊,三連也有許多科技人員也被派遣去了幹校,從事花葯培養的人員有所減少,但工作沒有停頓,培養技術的成熟,研究更加深入了。1973年在《中國科學》發表了署名文章後,引起了部分未署名的人員不滿,為保持團結,平息風波,分頭做了調解工作,又在1973年的《遺傳學通訊》第二期,以三室一組名義重新發表了「離體培養小麥花葯誘導花粉植株」的論文,內容幾乎與《中國科學》上發表的相同,在頁腳標註了參加工作的全體人員名單15人,除了原有署名的歐陽俊聞、莊家駿、胡含、曾君祉外,另外11人是賈旭、郗子英、湯光才、姚珍、胡啟德、張炎、李良才、蔡祺星、谷明光、於錫厚、黃大年。又以三室二組名義發表了「誘導水稻花粉植株發生的某些因素及植株遺傳學表現的研究」的論文,同樣在頁腳標註了參加該項工作的12人名單,即使這樣,個別人員的情緒也沒化解。這時連隊編制已經取消,三連改為第三研究室,原連隊人員進行了重組,分設為5個研究組,部分人員分流到第四研究室。從事小麥花葯培養遺傳研究的組成三室一組,簡稱301組,組長莊家駿、副組長歐陽俊聞,研究組成員有胡含、曾君祉、賈旭、賈雙娥、郗子英。研究所的同事根據人員姓名之特點打趣,稱該組是「真真假假、稀裡糊塗、歐陽裝蒜」。研究組的人員也做了初步分工,分為花葯組織培養、細胞學遺傳分析、再生植株後代栽培與選育等部分。分工合作,研究工作開展順利,研製出土豆簡化培養基,提高了再生植株誘導頻率。離體花粉培養的細胞學觀察與遺傳分析都取得顯著進展,並選育出許多花粉植株新品系,送往各地試種。
小麥花葯培養研究取得的成就與延續至今的應用
小麥花葯植株培養成功後,經過幾年選育,培育出第一個優良花粉小麥新品種「花培一號」,在昆明郊區獲得大面積推廣種植。為此在國內舉辦了多期花培技術培訓班,在全國掀起花葯培養熱潮,幾年後全國就有20多種植物花粉培養獲得成功。並應邀舉辦了國際植物組織培養培訓班和學術討論會,極大地提高了中國在國際科技界的聲望和地位。這項成果使得301組在1978年3月舉辦的「全國科學大會」上獲得表彰,評為先進集體。
為了改善科研基礎條件,進一步提高花葯培養技術和加強遺傳學機理研究,小麥花培課題組擴增了人員,並拆分為2個科研小組,相互獨立又相互關聯。由莊家駿、歐陽俊聞領導的小組主要開展花粉培養技術的研究,通過對誘導、分化培養基的激素、生長素、碳源、無機與有機元素的配比組合調整,以及溫度前處理等培養條件的優化,研發出適合小麥花葯、花粉培養的新型土豆培養基,極大地提高誘導再生頻率。小麥花葯培養取得的一系列成績,在2001年獲得了中國科學院自然科學一等獎。胡含小組側重細胞遺傳學機理的研究探索,通過對小麥花粉愈傷組織的染色體變異、花粉植株體細胞、花粉母細胞的變異現象持續觀察研究,揭示了小麥花粉植株的變異普遍性及其規律與機制;發現和論證了在花粉植株水平上配子類型充分表達的遺傳規律,提出了小麥花葯培養遺傳機理和單倍體育種體系。不僅有遺傳學理論研究意義,也有育種應用價值,對小麥品種改良上有重要意義。這項研究曾獲得1997年的國家頒發的自然科學二等獎。
隨著時代科技進步,生命科技的突飛猛進,組織培養、花葯培養熱潮早已消退。但時至今日,小麥花葯培養、單倍體育種技術作為常規實用的方法依然被國內外許多科研院所採用,繼續開展研究及應用。國內外學術刊物時能讀到相關的科研論文,國內也始終未終止花葯培養的研究。例如石家莊市農科院在2000年後才組建了花培實驗室,至今依然大規模利用花葯培養技術開展小麥花粉植株培育工作,選育出許多新品系和優良新品種,取得了很多成果和效益。