Nanopore宏基因組測序揭示汙水處理過程中可移動抗生素抗性基因組

2020-12-14 美格基因

三代宏基因組本領大，相關文章更同樣層出不窮，今天給大家分享一篇Microbiome上的文獻，看看三代宏基因組是如何在文章中大展身手！

題目：Mobile antibiotic resistome in wastewater treatment plants revealed by Nanopore metagenomic sequencing

作者：You Che 等

期刊：Microbiome

時間：2019.03

影響因子：10.465

DOI：10.1186/s40168-019-0663-0

一、 研究背景

汙水處理廠（wastewater treatment plants = WWTP）作為人類與環境之間的獨特接口，具有豐富的微生物遺傳多樣性，可通過水平基因轉移（HGT）促進ARGs的交換。本研究報導了第一個基於Nanopore和Illumina測序的快速分析遺傳位置並跟蹤ARGs的宿主的workflow，尤其是在汙水處理過程中可能攜帶ARGs的病原體的。此外，結合培養和Nanopore測序技術，確定了三種WWTPs進水和出水中多重耐藥菌的表型與基因型之間的相關性。

二、實驗設計

從香港的三個大型WWTPs收集了九個樣品（進水、活性汙泥和出水各3個），用於DNA提取，並分別進行Illumina和Nanopore測序及分析。此外每個WWTPs再收集1份樣品用於多耐藥性細菌的分離。

三、研究結果

1.質粒和ICEs攜帶的ARGs在WWTPs的抗性組中佔主導地位

WWTPs的進水、汙泥、出水的抗性組表現在9個環境宏基因組樣本的1791個攜帶ARG的長reads和316個contigs，基於它們的HGT潛力分為2大類：細胞間可移動組和染色體組。通過Nanopore測序的可移動組ARGs平均佔ARGs總數的55%，染色體上的ARGs佔29%，此外還有16%不能明確分配給這兩個組中的任何一個。在SARG資料庫中的幾乎所有ARGs類型都在可移動組中檢測到，表明這些ARGs在質粒和ICEs廣泛分布（圖 1）。

圖1 抗生素抗性基因遺傳背景解析

2.MGEs和宿主溯源揭示ARGs的傳播和持續存在

在這項研究中觀察到了顯著的抗性組流動，因此對MGEs相關的ARGs和位於染色體上的ARGs的宿主進行追溯（圖 2）。由質粒攜帶的屬於8大類的29個ARG亞類至少在3個WWTPs中的1個中檢測到（圖 2a）。29個ARG亞類，有23個是所有WWTPs共有的，有10個在所有3個出水中檢測到。這與先前的研究結果一致，即從WWTPs中分離的質粒編碼大部分在本研究中檢測到的持續存在的ARGs。

由ICEs攜帶的ARGs也可在處理過程中追溯到。4種ARG，包括cfxA，mefA/E，tetQ，和tetM在所有3個WWTPs中都檢測到（圖 2b）。

同樣的，還確定了位於染色體上的ARGs的宿主和分布模式（圖 2c）。結果表明，WWTPs的處理過程中存在高度多樣性的ARGs，與它們相關的質粒和IEs可能對ARGs的傳播有很大的貢獻。

圖2 通過移動原件和宿主追蹤識別廣譜可持續抗性基因

3.快速鑑定WWTPs中的潛在抗藥性病原菌

快速鑑定抗藥性病原體（antimicrobial-resistant pathogens，ARPs）對於有效控制汙水處理過程中病原體是很重要的。Nanopore測序的實時性和長reads可以快速鑑定並同時跟蹤WWTPs中潛在的ARPs。共檢測到16種相對豐度大於2%的物種，其中10種是潛在的病原菌，佔所有已鑑定ARBs的48.7%。所有已鑑定的潛在ARPs主要與gamma變形菌綱有關（74.4%）（圖 3a）。與預期的相同，進水樣本具有最高的ARP多樣性，而有5種物種，在處理的各個階段都有發現（圖 3c），但艱難梭狀芽孢桿菌（Clostridium difficile）僅在進水和出水中檢測到。這些結果表明，多種ARPs具有通過WWTPs處理過程進入接收環境的巨大潛能。

圖3 快速破譯潛在耐藥致病菌群

4.編碼多耐藥性質粒的細菌持續存在

表型與基因型相結合用於進一步驗證WWTPs中攜帶編碼多耐性質粒細菌的持續存在。從3個WWTPs的進水和出水培養物中均鑑定出可同時對4種不同的抗生素產生抗藥性的細菌。為了驗證基於Nanopore測序的微生物群落分析的準確性，對混合進水的多耐藥培養物進行了Illumina宏基因組測序。結果顯示Illumina測序分類結果在優勢種水平上與Nanopore測序獲得的基本一致。同時，使用宏基因組測序和16S rRNA（V4和V6區）的分類鑑定結果在科（family）水平上觀察到的結果基本一致。

抗性基因譜與給定抗生素的耐藥表型高度相關。除此之外，還檢測到五種不能用選擇培養基的抗性基因（圖 4b），說明在WWTPs中，多種抗性基因共現性普遍存在於該研究所篩選的多抗耐藥菌株中。在進水和出水培養物中均觀察到高豐度的磺醯胺抗性基因，表明它們在WWTPs的多耐藥細菌中普遍和持續的存在。

圖4 進出水多抗耐藥菌株基因型表型關聯分析

最後，研究了位於質粒上的ARGs的排列。考慮到本研究中使用的抗生素，僅對在入水和出水培養物中同時編碼至少四種類型的ARGs的reads進行了研究（圖 5）。這些reads的遺傳分析顯示這些基因參與質粒融合（即鬆弛酶和IV型分泌系統），表明在多耐藥細菌中存在融合質粒。此外，在同一質粒上檢測到了不同氨基糖苷ARGs亞型的共現（圖 5）。除了ARG亞型之間的共現模式外，Nanopore長序列還鑑定了編碼汞抗性的基因簇。許多類型的插入序列（IS）和轉座（Tn）元件在這些融合質粒上顯示出鑲嵌分布，這可能會增加HGT的可能性。實際上，這些豐富的重複元件也使得很難將Illumina reads組裝成足以闡明複雜ARG簇的排列的長contigs，在本研究中，Nanopore測序技術可以大大克服這一困難。

圖5 質粒攜帶的多抗耐藥基因簇

四、研究結論

這項研究運用「三+二」宏基因組學測序技術，顯著提升宏基因組數據的拼接效率和物種注釋精準度，相比單獨使用二代Illumina HiSeq測序平臺，可謂是取得了質的飛躍！研究全面揭示了三個汙水處理廠的進水、活性汙泥和汙水的抗性組背景，同時跟蹤了ARGs的宿主。極大地擴展了我們目前對WWTPs中抗性基因組的了解，並有助於建立baseline分析框架來研究環境中的ARGs。

五、美格基因優勢

美格基因宏基因組產品升級，引入Nanopore平臺助力宏基因組三代測序，新增「三+二」宏基因組測序策略，更全面獲取微生物物種的全基因組序列，助力微生物組研究！「三+二」宏基因組測序策略具有如下優勢：

1、更真實反映菌群實際組成

長讀長Reads能夠更為精準地鑑定微生物種類，有效提高微生物群落鑑定的解析度，更加真實的反映菌群的實際組成。

2、組裝效果更佳

高質量組裝

Contig N50增長超過60%，輕鬆解決組裝問題。

更精確預測

基因數量提升16%，多獲得30%完整基因。

個性化分析

Bins數量提高17%，實現高質量草圖「0」的突破。

註：以上數值均從測試數據中得出，具體以實際項目情況為準。

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