《最後的晚餐》完成之時，義大利已開始陷入強鄰侵擾、烽火遍地的混亂之中。米蘭把法國軍隊請入義大利，法國國王帶著火炮鐵騎從北部一直南下到那不勒斯，佛羅倫斯告急，憤怒的市民把美第奇統治者驅逐出境，恢復了共和體制，這是1494年的事。
後來，米蘭又與法國鬧矛盾，法軍攻陷米蘭，俘虜了米蘭公爵。在公爵府工作的達·文西只好回到故鄉，這時佛羅倫斯城市共和國雖然處境艱難，但文化上卻處於一個夕陽無限好的短暫而燦爛的時期。達·文西、米開朗基羅、拉斐爾和其他許多著名大師都在此工作。
達·文西在佛羅倫斯住了6年，後來又到米蘭，最後去了法國並在那裡去世。應該說，在故鄉的這幾年間是他藝術創作的一個黃金時期，他的藝術成就得到廣大市民的高度稱讚，一有作品展出，參觀者便摩肩接踵，絡繹不絕。在這一時期，他完成了他最有名的傑作——《蒙娜麗莎》。
它原是一幅肖像畫，女主人是佛羅倫斯銀行家吉奧亢多的夫人。當時，她年約24歲，按容貌講絕非絕色佳麗，可是畫家卻通過這位夫人的形象而寄託了他對人的理想典型的創造。他為此畫耗費心血達4年之久（1503—1506年），完成後沒有把它交給畫主而一直留在身邊，並把它帶到法國直至去世。所以，它現在成為巴黎羅浮宮的珍藏，也是全世界公認的古往今來最著名的畫作。
我們可以看到，畫中的夫人笑容微妙，坐姿優雅，但細看之下便會覺得她的這一形象具有非常豐富而含蓄的內蘊，她神秘的微笑似乎蘊意無窮，而背景山水則是迷濛蒼茫，意境深遠。他能做到這一點，除了把他的煙霧筆法和明暗造型發揮到登峰造極的境地之外，主要得力於他對人體（他所謂的小宇宙）和自然（他所謂的大宇宙）精深的科學研究。
前面提到，達·文西強調對人的科學考察應從形體細部外表觸及靈魂，也就是思想和性格。具體到對蒙娜麗莎容貌的描繪，他通過自己長年研究發現人的面容唯有眼角和唇邊等部位的微妙變化對表露感情最起作用，所以他把蒙娜麗莎的雙唇兩邊和眼角眼神表現得似笑非笑。
在這裡，他極好地把握了精確與模糊的辯證關係，從而做到表情含蓄，妙不可言。人們形容蒙娜麗莎的微笑會因人而變，悲傷者看她會覺得她是多愁善感，滿腹心事；樂觀者看她則會覺得她開朗豁達，含情脈脈。
有人說她莊靜典雅猶如聖母；有人說她神秘莫測勝過妖精……總之，從一個具體面容引發如此豐富聯想的肖像畫，在世界藝術珍品中絕無二例。同樣，背景山水的迷濛渺茫，也是達·文西研究自然景物出神入化，把實景的深遠與夢境的恍惚辯證結合起來的結果。
前面提到他的青山綠水具有中國畫的韻味，在《蒙娜麗莎》這幅肖像畫中，他也大膽地把類似中國山水畫的幽微意境與其擅長的地質地貌寫生結合起來。畫中山巒突兀，煙嵐迷茫，既有高山平湖，也有溪水彎流。取景也不用西方風景畫常見的平視而用鳥瞰角度，而且人物兩邊的背景山水在鳥瞰透視的位置上也有微妙差別：
她左手邊（圖右）山水位置略低，因此看起來覺得略微靠近觀者，而她右手邊山水則位置略高，更有遠山深谷之感。與此相聯繫，若專看圖右邊我們會覺得蒙娜麗莎離我們較近，而專看圖左邊則會覺得她離得較遠。這種具有變化的微妙關係與蒙娜麗莎嘴角微笑的難以捉摸起了互相烘託的作用，可謂相得益彰，使藝術手法的神奇妙用和畫幅氣氛的靈通變幻達到無以復加的程度。
當然，按文藝復興藝術表現技法與思想內容相結合的特點，人們自然會感到在這幅最完美的肖像畫中，人文主義關於人的崇高理想也得到了最光輝的體現。