1927年的南昌起義，揭開我黨獨立領導武裝鬥爭，創建革命軍隊的序幕，其實在此之前，就有一支武裝力量完全由我黨獨立領導。
1924年，兩黨合作正式形成，為了建立革命武裝，周總理與孫中山商議組建鐵甲車隊，由徐成章擔任隊長，廖乾吾任黨代表，而剛從黃埔畢業的一期生周士第擔任見習軍官（後為副隊長），協助鐵甲車隊的籌建工作。
鐵甲車隊三位負責人都是我黨黨員（周士第24年12月入黨），所以說這是第一支由我黨獨立領導的武裝力量，第二年徐成章趕赴廣寧支援農民運動，周士第就由副隊長升為隊長，正式成為這支隊伍的領導者，從這可以看出周士第在我黨中的資歷是很深的。
在平定楊希閔、劉震寰叛亂，以及第二次東徵討伐陳炯明戰役中，周士第率領鐵甲車隊立下大功。
有一次沙魚湧工人糾察隊被陳炯明殘部包圍，周士第率鐵甲車隊前去救援，在深圳莢勇與十倍於己的敵人血戰，當時周士第身上七處負傷，仍堅持帶隊衝鋒殺敵，最終率部突出重圍，當時在主席的號召下，廣州曾掀起向「以周士第為首的鐵甲車隊學習」的熱潮。
北伐戰爭前，鐵甲車隊擴編為國民革命軍第四軍獨立團，團長為葉挺，這就是大家熟悉的葉挺獨立團，周士第為團參謀長兼一營營長。北伐開始後，葉挺獨立團作為北伐先遣隊率先出發，而周士第率一營走在隊列最前方，所以被稱為「北伐先鋒的先鋒」。
鑑於獨立團在北伐時期的精彩表現，戰後葉挺獨立團擴編為第四軍第25師，師長李漢魂、副師長葉挺，在葉挺的舉薦下，周士第接了葉挺的班，擔任73團（葉挺獨立團改編）團長。
1927年8月1日，他與組織派來領導25師起義的聶帥商議，利用部隊午休時機，以野外訓練的名義將部隊帶出駐地，待師長李漢魂發覺後，周士第已率領起義部隊乘坐火車南下，於次日到達南昌。
部隊改編後，由周士第擔任師長，當時他的部下人才濟濟，很多日後都成為我黨的大人物，如73團指導員是陳毅，下面二營長是周子昆，還有一個連長是林帥。另外75團還有一位見習排長是開國大將許光達，此時周士第的地位和資歷比元帥都高。
南昌起義隊伍孤立無援、接連失利，朱老總就派周士第與李碩勳分別去香港、上海尋找黨組織，11月底周士第到達香港，找到了李立三匯報了南昌起義部隊的狀況，在等待下一步指示期間，染上瘧疾。養病期間，我黨領導廣州起義，起義失敗後很多同志流落香港街道，不少被逮捕，在緊張的局勢下，周士第在別人幫助下去了南洋，卻與組織失去聯繫。
1928年冬，回國後的周士第一直堅持反蔣鬥爭，1930年11月不幸入獄，幸虧在宋慶齡的周旋下被營救出獄，而與他同期被捕的鄧演達卻遭遇不測，這次危險經歷並沒有擊退他堅持鬥爭的決心，不過直到1934年2月他才重新與組織取得聯繫，回到中央蘇區。
幾個月後，周士第跟隨中央紅軍開始了長徵，1935年初周士第經過審查後允許重新入黨，被任命為幹部團指揮科科長，到達陝北後擔任紅15軍團參謀長，在三大主力會師後，周士第又成為紅二方面軍參謀長。
經歷八年抗戰，周士第已是晉綏軍區副司令員，1948年晉冀魯豫第八、第十三、第十五縱隊組建成華北軍區第一兵團，徐帥任司令員兼政委，周士第為副司令，後第一兵團改編為第十八兵團，1949年5月，周士第升為兵團司令員兼政委。
1955年身為正兵團級的周士第被授予上將軍銜，而他當年的部下有大將也有元帥。