放牧引起的微生物組變化驅動草甸草原土壤有機碳的轉化和生產力的提高
Grazing-induced microbiome alterations drive soil organic carbon turnover and productivity in meadow steppe
Microbiome
Impact Factor 10.465 | CiteScore 9.86
發表日期：2018-09-20
第一作者：Weibing Xun(荀衛兵)1,2
合作作者：Ruirui Yan(閆瑞瑞), Yi Ren(任軼), Dongyan Jin(金冬梅), Wu Xiong(熊武), Guishan Zhang(張桂山), Zhongli Cui(崔中利)
主要單位：
1南京農業大學江蘇省有機固體廢棄物利用重點實驗室(Jiangsu Provincial Key Lab for Organic Solid Waste Utilization, National Engineering Research Center for Organic-based Fertilizers, Jiangsu
Collaborative Innovation Center for Solid Organic Waste Resource Utilization, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)
3中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所(National Hulunber Grassland Ecosystem Observation and Research Station,Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)
寫在前面
分享標題：Microbiome：微生物組變化驅動土壤有機碳轉化和生產力的提升
關鍵字：溫帶草甸草原，牛放牧，微生物組成，土壤培養，土壤有機碳降解酶活性，土壤生產力
點評：作者通過設置不同的放牧強度梯度研究了不同的放牧強度對土壤微生物群落的影響及其對土壤生產力的影響；由於土壤微生物易受土壤水分和溫度以及許多其他特徵的(季節變化)影響，同時為了研究土壤有機碳周轉化對季節變化的響應，因此作者結合微宇宙培養實驗進一步設置了溫度及含水量梯度以期更嚴謹的更全面的解答放牧對土壤微生物群落，SOC轉化和土壤生產力的綜合全面的影響，本文工作量大信息量大，論據充實，通過一系列的實驗結果結合精彩的討論有力的論證了放牧對土壤微生物群落組成、多樣性、活性和穩定性的變化的影響，並論證了微生物對土壤有機碳的轉化和生產力的貢獻。
摘要
背景
放牧是草地生物多樣性和生產力的重要調節因子。然而，我們對放牧引起的地下群落、過程和土壤生產力變化的認識是有限的。在此，我們通過長期封閉的放牧草甸草原，調查了季節性變化下放牧對土壤有機碳（SOC）轉化，微生物群落組成，抵抗力和活性以及微生物對土壤生產力的影響。
結果
結果表明，放牧對草甸草原土壤微生物群落和生態系統功能有顯著影響。在輕度放牧強度下，微生物的α多樣性最高，而在中等適度放牧強度下微生物的β多樣性最高。放牧使微生物組成由真菌主導型轉變為細菌主導型，由緩慢生長型轉變為快速生長型，從而導致以真菌為主導且以頑固性有機碳為主的食物網向以細菌為主導且以不穩定有機碳為主的食物網的轉變。此外，分別在真菌和細菌主導的群落中觀察到較高的真菌頑固性SOC降解活性和細菌不穩定SOC降解活性。值得注意的是，細菌群落的魯棒性和細菌活性的穩定性與α多樣性有關，而真菌群落及其相關活性的魯棒性卻並非如此。最後,我們觀察到是微生物α-多樣性而不是SOC的轉化可以預測土壤生產力。
結論
我們的發現表明，放牧對土壤微生物群落，SOC轉換和土壤生產力具有強烈影響，且土壤微生物α多樣性在控制草甸草原生態系統功能方面具有重要的積極作用。
背景
放牧是最廣泛的土地用途之一，佔全球土地面積的三分之一以上。據報導，過度放牧會降低植物區系多樣性和生物量，可能是草地退化最普遍和最顯著的過程。植物區系多樣性對生產力和其他生態系統功能的重要性已被許多研究證實。然而，植物區系多樣性的重要性最近受到了質疑。其中一些問題表明，許多陸地生態系統的生產力取決於資源的有效性。特別是土壤微生物，由於其在凋落物分解、生物地球化學養分循環、土壤團聚和促進肥力等方面的關鍵作用，其是維持生態系統功能和提高土壤生產力的重要組成部分。因此，促進從地面研究向地下研究的轉變，對提高我們對土壤微生物行為的認識具有重要意義。這些研究可以為生態學家提供深入了解地面上觀察到的看似不同的結果的見解。到目前為止，雖然一些調查已經研究了自上而下的相互作用，但我們對土壤微生物群落和生態系統維持土壤生產力的機制的認識是有限的，特別是放牧引起的地下群落的變化。
眾所周知，土壤微生物群落的組成和功能性能都可能受到氣候，植被和土壤條件等環境變量的強烈影響。在草原生態系統中，放牧是一個關鍵的調節因子，它可以直接或間接地影響上述環境變量，進而影響土壤微生物群落的多樣性和組成，從而改變土壤的功能性能和養分供應模式。事實上，一些研究表明，放牧對土壤微生物群落和土壤碳(C)和氮(N)的有效性有顯著影響。不同的放牧強度可能改變土壤細菌和真菌的分布，影響土壤呼吸。儘管有這些發現，但關於放牧對草地生態系統中地下微生物群落和土壤固碳能力及生產力的影響的研究卻很少。因此，需要進一步研究這些自頂向下和自底向上綜合的相互作用。
內蒙古草原是歐亞草原的重要組成部分，位於歐亞草原東緣的呼倫貝爾草原是最具代表性的溫帶草甸草原，土壤肥力和生物多樣性高。這片草地在高放牧強度下會發生物種的減少，這對於我們的研究是有利的。因此，為了探索放牧對土壤微生物群落的影響及其對土壤生產力的影響，我們於2009年在中國農業科學院呼倫貝爾草地生態系統研究站(HGERS)進行了長期放牧強度梯度試驗。我們對16S和內部轉錄間隔區（ITS）進行了rRNA基因擴增子測序，以評估土壤微生物群落的結構。對於微生物對SOC轉化的影響進行了多種SOC-酶解法的研究。本研究的目的是調查放牧引起的土壤微生物群落組成、多樣性、活性和穩定性的變化，並研究微生物對土壤有機碳的轉化和生產力的貢獻。
結果
放牧的集約化促發了快速生長的細菌主導的群落
Intensification of grazing triggers fast-growing and bacteria-dominated communities
放牧對土壤細菌和真菌豐度有顯著的影響，而季節變化則沒有。細菌豐度在G2和G4組較高，在G8組較低(圖. 1a)。而G0的真菌豐度最高，且隨放牧強度的增加而降低(圖. 1b)。過度放牧(G8)導致了細菌和真菌數量的顯著減少。當計算細菌/真菌比例時，我們發現較高的細菌/真菌比例與較高的放牧強度相關，這表明隨著放牧強度的增加，細菌變得盛行(圖. 1c)。
圖 1aLg轉換的細菌豐度，bLg轉換的真菌豐度，c所有放牧強度下的細菌/真菌比
a Lg-transformed bacterial abundance, b Lg-transformed fungal abundance, and c bacteria/fungi ratio at all grazing intensities
採用Duncan’s多重比較檢驗，獨立進行細菌豐度、真菌豐度和細菌/真菌比的統計分析。結果以字母a到c顯示。
我們的測序結果表明，響應於牛放牧的細菌和真菌群落存在顯著差異。在中度以下(G0和G2)和中度至重度(G4和G8)放牧強度之間觀察到最強烈的差異。就土壤細菌而言，大多數Acidobacteria,Chloroflexi,Planctomycetes,與Verrucomicrobia等門水平緩慢生長的細菌在G0和G2中含量更高。而生長最快的Bacteroidetes,Firmicutes,Nitrospira,和Proteobacteria等門水平的細菌在G4和G8中含量更多，最豐富的真菌門是Ascomycota,Basidiomycota,Glomeromycota,和Zygomycota。其中，Ascomycota是最常見的門，相對豐度為80.6 ~ 89.9%。此外，在G0和G2中，來自Glomeromycota和Zygomycota及一些屬於Ascomycota(Geoglossomycetes,Pezizomycetes,Sordariomycetes等)的類更豐富。值得注意的是，季節變化對微生物組成的影響比放牧要小。
放牧影響微生物群落的多樣性和魯棒性
Grazing affects the diversity and robustness of microbial communities
我們通過使用α-diversity(在相同位點水平的物種豐富度),γ-diversity(在地塊水平上的物種豐富度),和β-diversity(同一地塊取樣點間群落相異度)同時進行對土壤微生物多樣性的評估。首先，輕度放牧強度（G2）導致最高的土壤微生物α多樣性，而高放牧強度（G8）導致最低的α多樣性，其顯著性由樣品的Shannon指數(圖.2a)和OTU豐富度表明。同時，中等放牧強度（G4）的地點具有與G0相同水平的微生物α多樣性。其次，觀察到微生物的γ多樣性在G2中最高，在G8中最低。但是，在小區水平上，G4具有與G2相同的物種豐富度。第三，使用未加權和加權Unifrac距離計算微生物群落的β多樣性，G4的群落表現出最大的β多樣性，其次是G2，G0和G8。
圖 2
a在6月和8月份細菌和真菌的α-diversity(Shannon指數)。採用Duncan多重比較檢驗，在兩個季節對Shannon多樣性進行了獨立的統計分析。結果以彩色字母a到c表示;
b細菌和真菌群落的非度量多維尺度(NMDS)分析。
非度量多維標度(NMDS)分析用於比較微生物群落。根據放牧強度，細菌群落在第一個主坐標上被區分開來(圖. 2b)。分離的模式與放牧強度梯度一致，即由低放牧強度梯度的G0和G2到中度放牧強度的(G4)再到高放牧強度(G8)的梯度。此外，群落在第二個主軸中，被季節變化分隔開來，表明土壤細菌群落對季節變化也有響應。此外，真菌群落也觀察到類似的分離模式。
放牧對草地微生物群落組成和多樣性有重要影響，這可能改變草地微生物群落的魯棒性。事實上，群落的魯棒性與其對季節變化的反應有關。因此，我們使用標準化的OTU相對豐度進行了OTU差異分析，並於6月和8月在每個放牧強度水平下收集的土壤樣品之間進行了對數比測試，以確定群落的魯棒性。正如掃帚形的「尾巴」所表示的那樣，其中更發散的「尾巴」表示弱魯棒性，G8(圖. 3d)細菌群落的季節變化大於G4(圖. 3c)菌群，其次是G2(圖. 3b)和G0(圖. 3a)菌群，說明隨著放牧強度的增加，細菌群落的穩定性下降。相比之下，真菌群落的季節變化在所有放牧強度下波動較大(圖. 3e to 3h)。
圖 3 6-8月各放牧強度下標準化OTU豐度的季節變化
Seasonal variations of normalized OTU abundances between June and August for every grazing intensity
aG0中細菌群落的季節變化。bG2細菌群落的季節變化。cG4細菌群落的季節變化。dG8細菌群落的季節變化。eG0中真菌群落的季節變化。fG2中真菌群落的季節變化。gG4中真菌群落的季節變化。hG8中真菌群落的季節變化。
放牧改變了土壤有機碳的降解和功能的穩定性
Grazing alters SOC decomposition and functional stability
為了研究土壤有機碳周轉化對季節變化的響應，我們通過改變土壤含水量和溫度條件進行了土壤培養試驗(溼度、溫度通過田間調查確定)。我們測定了土壤中各種酶的活性，包括SOC降解酶的活性(範圍從不穩定的到難分解的SOC的降解)。
我們發現，不同培養條件下土壤酶活性是不同的，而微生物豐度卻沒有(qPCR數據未顯示)。有趣的是，不穩定SOC的降解酶(轉化酶、麥芽酶和澱粉酶)活性與細菌豐度呈正相關(R≥ 0.597,P≤ 0.019)，與真菌豐度呈弱相關(R≤ 0.286, 無顯著性)(表 1)。然而，難降解SOC的降解酶(果膠酯酶、纖維素酶、木聚糖酶)活性與真菌豐度呈正相關(R≥ 0.659,P≤ 0.009)，與細菌豐度呈弱相關(R≤ 0.262, 無顯著性,
除了木聚糖酶的P= 0.035)。此外,β-葡糖苷酶的活性與細菌(R= 0.628,
P= 0.021)和真菌(R= 0.585,P= 0.015)豐度都呈正相關。
表 1 SOC降解酶活性與細菌、真菌豐度的斯皮爾曼秩相關
Spearman’s rank correlations of SOC-decomposing enzyme activities with bacterial and fungal abundances
lglog10變換,n.s.
不顯著
為了合理評價微生物活性，我們計算了酶活性與微生物豐度的比值(計算中只使用了顯著相關的活性和微生物豐度)。土壤微生物活性對水分和溫度擾動的響應不同;在溫度或水分梯度下，細菌活性最高的是G4，最低的是G8。但是，在溫度或水分梯度下，真菌活性最高的是G0，最低的是G8。同時，在相同放牧強度下，由於水分和溫度擾動下真菌活性的高變異性，真菌活性似乎比細菌活性更敏感。
通過微生物活性的正態分布來驗證在不同水和溫度條件下微生物活性的穩定性(圖. 4)。最右邊的矩形表示微生物活性更高，而較小的矩形表示微生物活性在微擾下更穩定。在本分析中，G4的細菌活性最高，而G0的細菌活性最穩定。此外，細菌活性最強的單獨預測因子是細菌β-多樣性(R= 0.794,P= 0.002)，土壤細菌活性也顯著相關於土壤pH值(R= 0.726,P= 0.004)、細菌γ-diversity(R= 0.692,
P = 0.034),細菌α-diversity(R= 0.625,P= 0.045)(表 2)。然而，在G0中真菌活性最高，且真菌活性的巨大變化表明，真菌活性對季節變化敏感，而不是對牛放牧敏感。此外，真菌活性最強的單獨預測因子是真菌豐度(R= 0.829,P= 0.001)，土壤真菌活性也顯著相關與真菌α-diversity(R=
0.571,P= 0.039)和SOC濃度(R= 0.507,P=
0.037)。
圖 4 在不同的培養條件下，微生物活性呈正態分布
Normally distributed microbial activity under various incubation conditions
矩形的位置和大小表示活性和穩定性。最右邊的矩形表示更高的活性。較小的矩形表示更穩定的活性。只考慮了顯著相關的活性和微生物豐度。
表 2 微生物活性與微生物多樣性、豐度、土壤pH值和SOC濃度的斯皮爾曼秩相關(使用Mantel檢驗估算)
Spearman’s rank correlations of microbial activity with microbial diversity, abundance, soil pH, and SOC concentration (estimated using Mantel tests)
a細菌的活性,利用轉化酶、麥芽糖酶和澱粉酶的活性來估計
b真菌的活性，利用木聚糖酶、纖維素酶和果膠酯酶的活性進行評估
土壤生產力相關於微生物的α-多樣性
Soil productivity is related to microbial α-diversity
利用地下SOC濃度以及地面植物和牲畜生物量來估算土壤生產力。根據Mantel檢驗結果，我們發現微生物活性與土壤生產力之間存在微弱的相關性。然而，線性回歸分析結果顯示，6月和8月的細菌和真菌的Shannon多樣性指數與SOC濃度呈顯著正相關(圖. 5a, b)。同時，我們發現微生物Shannon多樣性指數與平均植物生物量積累(R2≥ 0.562,P圖. 5c; andR2≥
0.577,P圖. 5d) 之間以及微生物Shannon多樣性與平均牲畜生物量積累(R2≥ 0.746,P; andR2≥
0.695,P圖. 5f)之間存在顯著的正相關關係。
圖 5 微生物α-多樣性與SOC濃度(a細菌;b真菌)、平均植物生物量積累 (c細菌;d真菌)、平均牲畜生物量積累(e細菌;f真菌)的線性回歸分析
Linear regression analysis between microbial α-diversity (Shannon index) and SOC concentration (a bacteria; b fungi), average plant biomass accumulation (c bacteria; d fungi), and average livestock biomass accumulation (e bacteria; f fungi)
討論
放牧使微生物群落從由真菌主導、緩慢生長型向細菌主導、快速生長型轉變
Grazing shifts microbial communities from fungi dominated and slow growing to bacteria dominated and fast growing
不同放牧強度對土壤環境條件和微生物群落有直接和間接的影響。家畜以地上植物為食，並將其中近一半轉化為糞便，這有利於細菌的生長。然而，在過度放牧的情況下，過多的踐踏會導致土壤的容重過高，而植物覆蓋度的缺乏又會引起土壤溼度和溫度的劇烈波動，使得土壤微生物的生長環境十分惡劣。因此，我們觀察到細菌豐度的跳躍變化。此外，細菌/真菌比率的增加表明，在較高的放牧強度下，細菌已成為主導微生物，而土壤真菌的豐度下降了，這可能是因為真菌喜愛較少擾動的生態系統。
關於放牧對微生物群落組成的影響，我們觀察到不同的微生物類群表現出不同的行為。由於長期的雙核生物狀態，許多擔子菌群對環境擾動和生長緩慢敏感，其可以用作擾動強度的真菌指示劑。此外，被稱為叢枝菌根真菌(AMF)的Glomeromycota門與植物生物量密切相關。因此，由於土壤擾動加劇，植物豐度和生物量下降，集約放牧條件不利於這些真菌的定殖。
特別是，雖然地上植物幾乎一半以糞便的形式歸還，但集約放牧條件下有限的牧草可能會迫使牛消耗更多的能量在場址周圍覓食，從而增加地上牧草的消耗和地下養分的周轉，從而降低SOC的濃度。而在該地區，集約放牧增加了Bacteroidetes,
Proteobacteria,Nitrospria等的相對豐度。這些豐富的細菌類群主要是嗜營養菌，它們通常快速生長，並且與SOC濃度呈正相關。這一結果最初令人驚訝，因為之前的研究表明，密集放牧誘導了革蘭氏陽性菌的增殖，而這一結果僅在本研究中最高放牧強度下的細菌門Firmicutes上得到證實。我們認為糞便中含有比植物殘體更多的有效營養物質和不穩定的有機基質，從而促進嗜營養菌的生長。綜上所述，這些發現表明放牧將微生物群落從生長緩慢的真菌主導型轉變為快速生長的細菌主導型。
放牧同時改變了土壤細菌和真菌的多樣性，但對細菌和真菌群落的魯棒性有不同的影響
Grazing alters soil bacterial and fungal diversity simultaneously but has different impacts on the robustness of bacterial and fungal community
放牧可能通過改變優勢微生物之間的競爭相互作用和釋放/抑制從屬微生物來調節土壤微生物的多樣性；然而，過度放牧可能會對微生物多樣性產生負面影響。在這項研究中，G0和G4的微生物的α多樣性均顯著低於G2，但G4的γ多樣性與G2處於同一水平。這些數據表明，輕度放牧對局部和區域尺度上的土壤微生物物種豐富度都有積極的影響。但是，適度放牧降低了局部範圍內的微生物物種豐富度，但對區域範圍內的微生物物種豐富度影響不大。在中等放牧強度下，不同尺度下物種豐富度的這些變化導致了高水平的β多樣性。事實上，我們使用unweighted和weighted Unifrac 距離都證實了觀察結果。此外，這一觀察結果與Cline等人之前的研究結果一致，Cline等人進行了長期的有蹄類動物覓食強度試驗，並指出覓食強度與細菌豐富度(α-diversity)降低和明顯的細菌群落(β-diversity)增加有關。他們還預測，高覓食強度將導致土壤生物α-和β-多樣性的更大程度的降低。特別是，Griffiths等人認為，這些多樣性的變化主要對應於更大的環境變化。我們認為，這些發現可能是由於選擇性攝食造成的，這導致了當地營養供應和需求模式的改變，從而導致區域尺度上更大的環境異質性。
除了放牧的強烈影響外，季節變化對土壤微生物群落的影響也是同步的。從圖3的掃帚狀「尾巴」可以看出，隨著放牧強度的增加，土壤細菌群落的變化也越來越大。由於土壤微生物易受土壤水分和溫度以及許多其他特徵的影響，因此這些差異可能歸因於季節變化。例如，放牧會導致植物覆蓋率下降，從而導致土壤水分快速流失和土壤溫度急劇波動。因此，集約化放牧使土壤更容易受到季節波動的影響，並降低了土壤微生物的多樣性，因此，集約化放牧可能會降低群落的魯棒性。然而，與細菌群落相比，真菌群落在所有放牧強度下都有很大的差異。我們認為，植物的生長可能是引起真菌群落季節性變化的主要因素。這與Millard和Singh證明的細菌群落更受土壤特徵的影響，而真菌群落主要受植被的影響是一致的。
微生物組成和魯棒性決定了SOC的分解活性和穩定性
Microbial composition and robustness determine the SOC decomposition activity and stability
土壤細菌和真菌對SOC庫的影響不同;因此，放牧通過改變土壤中微生物的豐度和組成來影響SOC組分的大小和組成。一般來說，集約化放牧地需要更多的可利用養分來促進植物生長。因此，土壤微生物被迫形成一個群落，該群落表現出更高的養分轉化率。迄今為止，我們知道集約型放牧導致了土壤中細菌主導的食物網。我們的結果與這些觀察結果一致，表明細菌，尤其是快速生長的嗜營養菌在集約化牧場佔主導地位。我們檢測了幾種SOC分解酶的活性，以概述SOC的分解能力。SOC分解酶活性與微生物豐度之間的獨特關係表明，真菌在頑固的SOC轉化中更重要，而細菌在不穩定的SOC轉化中更重要。例如，真菌比細菌更有效地分解木質纖維素。此外，更多的嗜營養菌含有更多的不穩定SOC分解基因，這促進了不穩定SOC的轉換。因此，土壤細菌或真菌的優勢度調節了SOC的分解。
為了正確地表徵微生物的平均活性，我們計算了酶活性與微生物豐度的比值。這個比率類似於代謝商數(qCO2)，它被定義為每單位生物量的呼吸速率。我們觀察到土壤細菌活性(不穩定SOC的分解)在G4中最高，表明適度放牧增強了土壤細菌活性，而過度放牧則抑制了土壤細菌活性和不穩定SOC的分解能力。另一方面，在非放牧地點（G0），土壤真菌活性（頑固性SOC的分解）最高，這表明放牧的引入抑制了土壤真菌活性和分解頑固性SOC的能力。這一發現支持了以下假設：細菌和真菌分別是集約化放牧和輕度放牧草地上相對更重要的分解者。
我們觀察到預測細菌活性的最佳參數是細菌β多樣性,其次是土壤pH值。顯而易見的是土壤pH值對細菌的存活和活性有很強的影響；然而,很少有報告細菌β-diversity的影響。我們認為G4中細菌活性高的主要原因是嗜營養菌所佔比例高。因此，適度放牧可以促進草甸草原嗜營養菌的生長，增強細菌活性。然而，在過度放牧的土地上，嗜營養菌的活性會受到抑制。與細菌群落不同，真菌群落與土壤pH值關係較弱，後續研究證明土壤真菌多樣性和組成與SOC有關，而SOC與草地植物生長有關。此外，Keiblinger等人認為真菌的SOC分解效率對植被更為敏感，需要較高的真菌生物量。因此，真菌豐度與頑固性SOC分解效率的關係可以作為預測真菌在自然生境中活性的良好指標。
我們還發現，在集約化放牧點的細菌活動和所有放牧點的真菌活動均存在很大的波動，這分別與細菌和真菌群落的魯棒性有關。我們的發現與之前的結果一致，表明微生物的魯棒性決定了土壤功能的穩定性。重要的是，在不同的培養條件下，雖然我們沒有發現真菌的豐度有明顯的變化，但真菌的活性表現出相同的波動趨勢，這說明真菌的活性也對溼度和溫度敏感。綜上所述，這些發現表明土壤細菌活性主要在於豐富的嗜營養類群和土壤特性，而這些豐富的嗜營養類群是影響不穩定SOC分解效率的主要因素。此外，真菌活性主要受真菌豐度和植株生長的影響，是影響頑固性SOC分解效率的主要因素。
土壤微生物的α多樣性而非SOC轉化率可預測土壤生產力
Soil microbial α-diversity rather than SOC turnover rate predicts soil productivity
一般來說，在沒有自然生態系統幹擾的情況下，植物區系的複雜性決定了土壤的生產力。生態學家一直試圖利用受人類或食草動物幹擾的生態系統的植物區系多樣性來預測生態系統服務x(例如,土壤生產力)，但結果卻喜憂參半。Van Der Heijden等人總結說，封閉的養分循環發生在受真菌主導的食物網影響較小的土壤中，這些土壤通常支持緩慢的植物生長和較低的淨初級生產力。然而，我們發現，中度放牧誘導的細菌為主的食物網和更快的不穩定SOC轉化也沒有實現最高的生產力。我們推測，在以細菌為主的食物網中，快速的營養循環為快速生長的細菌提供了適宜的生長條件，這可能會使SOC庫從C匯向C源轉變，從而抑制植物的生長和生產力。在本文中，我們發現微生物α多樣性對土壤碳儲量和生產力有強烈積極的影響，這表明可能存在內部微生物學機制，以更高的微生物α多樣性而不是更高的養分周轉率來增加土壤C庫和食物鏈中光同化物的比例。因此，土壤管理強度和土壤微生物群落的相關變化可以引導生態系統的多種功能以及人類需求之間的權衡取捨，且仍然需要關注生態系統的功能。
結論
Conclusions
結果表明，不同放牧水平對草甸草原土壤微生物群落和生態系統功能有顯著影響(圖. 6)。放牧使微生物組成從生長緩慢的真菌主導群落轉變為生長迅速的細菌主導群落。我們觀察到真菌群落主要負責難降解的SOC的分解，並且真菌活性與真菌豐度呈正相關。另一方面，細菌群落主要負責不穩定的SOC的分解，且細菌活性與β多樣性相關。然而，在過度放牧的土壤中，微生物活性受到抑制。特別是，土壤生產力與細菌或真菌的活動無關，而與微生物的α多樣性有關。因此，我們認為放牧會通過調節土壤微生物群落和養分轉化來影響土壤生產力，而高的土壤生產力主要由微生物α-多樣性決定，但在草甸草原上並不需要很高的微生物活性。
圖 6 放牧對土壤微生物群落和土壤生產力影響的概述
An overview of the influence of grazing on soil microbial community and soil productivity
方法
研究方案設計
Study design
實驗場地位於中國農業科學院呼倫貝爾草原生態系統研究站(CAAS) (119°
94′~119°96′ E, 49°32′~49°34′ N) (中國內蒙古呼倫貝爾)。根據聯合國糧農組織/聯合國教科文組織的土壤分類系統，該站的土壤為慄鈣土。該地區為半乾旱大陸性氣候，年平均氣溫範圍近-3℃，年降水量範圍350~ 400mm。該地區植被具有典型的草甸草原特徵。羊草、黃芩、杜仲苔草、真葉苔、天牛柴胡、西伯利亞細葉為主導植物種。該草地採用隨機、完全區組設計，分6個等級的放牧強度進行試驗。本研究選取了6個放牧強度中的4個，密度為0、0.42、0.83、1.67牛ha-1即每小區0、2、4、8頭牛每小區，分別被設計記為G0、G2、G4、G8。從2009年開始，所有這些地方都被用作夏季牧場，放牧期從6月到9月。休牧期從10月開始，第二年5月結束。
土壤樣品採集和分析
Soil sample collection and analysis
分別於2015年6月(對於分別從處理G0, G2, G4, 和 G8中收集的土壤分別記為J0、J2、J4和J8)與8月(對於分別從處理G0, G2, G4, 和 G8中收集的土壤分別記為A0, A2, A4, 和 A8)採集土壤樣品。為了能夠同時檢測到α和β多樣性，我們建立了一種嵌套的採樣方法，其中所有採樣點都位於半徑為150 m，15 m，1.5 m和0.15 m的同心圓上。通過這種採樣策略，每個樣地總共收集了17個樣本。土壤樣品取自地塊中的直徑為10釐米的土壤巖心上部20釐米(去除枯枝落葉層)。所有樣品均用標準方法篩選、均質、再細分。用於測定理化性質的土壤被風乾，用於分子分析的土壤被保存在-80℃，直到提取脫氧核糖核酸(DNA)，用於建立微宇宙的土壤被保存於室溫。在中國農科院祁陽紅壤實驗站對所有土壤樣品的土壤性狀進行了評估，所使用的詳細方法在前面已經描述過。
微宇宙培養
Microcosm incubation
在本田間試驗中，不同的放牧強度導致了不同的植被覆蓋度，導致了地塊土壤含水量的差異，影響了土壤溫度。土壤含水量和溫度是影響土壤C分解的重要因素。因此，考慮到放牧引起的原位含水量和溫度條件的差異，並為了準確評估放牧對潛在SOC分解速率的影響，我們建立了土壤微宇宙，並在不同的水分含量和溫度條件下培育了這些微宇宙。G0的含水量(22%)定義為田間含水量的100%;選擇75％和50％的田間水分含量作為水分擾動處理。溫度擾動採用溫度梯度(24℃、33℃和42℃，與6月至8月間的溫度變化一致)。
土壤微宇宙是按照Xun等人的描述製備的。每個土樣建立18個重複的微宇宙(因此, 我們有18個微宇宙實驗×17個土樣×3小區重複= 918 每一放牧密度918個微宇宙)，每個微宇宙是通過將150克的新鮮土壤放入一個250毫升的瓶子中來構建的。加入無菌水，使水分保持在田間含水量的100%，微宇宙在黑暗中24℃預孵育。預孵育1周後，在18個重複的微宇宙中隨機選擇16個進行溼度和/或溫度擾動測試，其餘2個微宇宙和之前一樣繼續孵育(對照, 不擾動, 水分為100%的田間含水量，溫度為24℃)。附加文件4：Table S2描述了詳細的孵化條件。孵育期為2個月。
酶活分析
Enzymatic activity analyses
進行了以下酶活性測定:(i)轉化酶（EC 3.2.1.26），麥芽糖酶（EC 3.2.1.20），澱粉酶（EC 3.2.1.1），木聚糖酶（EC 3.2.1.8），纖維素酶（EC 3.2.1.4）和果膠酯酶（EC 3.1.1.11）的活性 ）分別以蔗糖，甲基多糖苷，澱粉，木聚糖，羧甲基纖維素和果膠為底物，採用3,5二硝基水楊酸比色法測定;（ii）使用改進的比色法，以硝基苯基糖苷為底物，測定β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）的活性。
DNA提取，qPCR，擴增子測序
DNA extraction, qPCR, and amplicon sequencing
用PowerSoil DNA提取試劑盒從0.25 g土壤中提取總DNA(Mo Bio Laboratories Inc.,Carlsbad, CA, USA) 。為了使DNA提取偏差最小化，在進行聚合酶鏈式反應(PCR)之前，將每個土壤樣本的連續三次提取的DNA匯集在一起。使用NanoDrop ND-2000分光光度計(NanoDrop, ND2000, Thermo Scientific, Wilmington, USA)根據260/280 nm和260/230 nm的吸光度比值評估DNA質量。提取的DNA保存在- 20℃，直到使用。
使用Power SYBR Green PCR Master MIX (Biosystems, Warrington, UK)在ABI 7500 Real-Time PCR系統(Applied Biosystems, CA, USA)上通過定量PCR (qPCR)分析細菌和真菌的豐度。使用的引物如下:F347(5-ggaggcagtrrggat-3)和R531 (5-ctnygtmttggctgc-3)(194bp)用於檢測細菌16S rRNA基因豐度，FungF(5-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3)和FungR(5-ATTCCCCGTTACCCGTTG-3)用於檢測真菌18SrRNA基因豐度。
利用引物515F (5 -GTGC CAGCMGCCGCGGTAA-3)和806R (5 -GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3)擴增細菌16S rRNA基因的V4高變區以評價細菌群落。利用引物ITS3 (5 -GCATCGATGAAGAACGCAGC-3)和ITS4 (5 -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)擴增真菌rRNA基因的內轉錄間隔區(ITS2)以評價真菌群落。PCR擴增子按等摩爾比混合，測序由Bion Biotechnology Co.， Ltd (南京, 中國)在Illumina MiSeq平臺上進行，分別對16S及其ITS rRNA基因擴增子池進行測序。使用UPARSE流程處理測序數據(http://drive5.com/usearch/manual/uparse_pipeline.html)。對原始序列進行質控。去重複後刪除單克隆序列和嵌合體序列，其餘序列以97%的相似度聚成可操作分類單元(OTU)
並分別利用Silva資料庫(Release 128) (https://www.arb-silva.de/) 和UNITE資料庫(Release date: August 2016)(https://unite.ut.ee/)對16S及ITS rRNA基因進行物種分類。16S及ITS rRNA基因序列可在NCBI Sequence
Read Archive 中找到，登錄號為SRP117970和SRP119882
數據分析
Data analyses
測序數據分析如下:(i)每個物種分類的百分比被指定為相對豐度（ii）物種分類的α多樣性的計算方法是單個採樣點的OTU豐富度和Shannon多樣性，(iii)將物種分類的γ多樣性計算為實驗小區的OTU豐富度，及(iv)β-diversity(系統發育群落相異度)使用FastUnifrac計算。採用Duncan多重比較檢驗計算樣本間的統計學意義。採用Tukey’s HSD檢驗計算兩樣本間的統計學意義。使用Mantel檢驗和Spearman相關計算相關係數。所有統計分析均採用R軟體(version 3.3.2)中的Vegan包(v.2.4-1)。
編譯：馬騰飛 南京農業大學
責編：劉永鑫 中科院遺傳發育所
Reference